新型肝片吸虫多表位疫苗的研究

发布时间：2017-04-08 10:04

  本文关键词：新型肝片吸虫多表位疫苗的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本课题组依据机体对肝片吸虫的免疫保护机制和表位疫苗的构建理论,合理选择肝片吸虫鞘脂激活样蛋白2(Fh SAP-2)的Th和B细胞抗原表位,结合生物信息学软件的分析,设计出一个结构新颖的多表位疫苗CTB-SAPE、两个单表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。进一步通过基因克隆、表达及蛋白纯化等技术,获得该疫苗的重组蛋白,继而利用免疫学实验鉴定了多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特异性。实验方法及结果简述如下:1、肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2(Fh SAP-2)的原核表达及分离纯化生物信息学软件Optimum TM Codon优化密码子适应指数(CAI)、最优密码子频率(FOP)及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的Fh SAP-2基因序列,并克隆到原核表达载体p ET22b和p ET28a中,经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的蛋白。结果 Optimum TM Codon获得优化后的Fh SAP-2序列,经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒p ET22b-Fh SAP-2、p ET28a-Fh SAP-2构建成功,进一步实验结果表明Fh SAP-2在p ET28a中包涵体部位表达,可溶部位不表达;在p ET22b中可溶部位表达量低,包涵体部位无表达。继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的Fh SAP-2蛋白。2、多表位疫苗CTB-SAPE的设计及重组表达载体的构建本课题组在前期文献调研基础上合理选择Fh SAP-2优势B和Th细胞抗原表位,通过表位疫苗的构建理论和生物信息学分析,对Fh SAP-2抗原表位的连接顺序、间隔序列(Linker)和表位拷贝数,加以分析和确定,为了更好地激活粘膜免疫,在疫苗的设计中引入了分子内佐剂CTB,最终设计出具有科学合理结构的肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE,并在此基础上设计两个单表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。利用酶切和PCR技术构建了重组表达载体p ETCTB-SAPE、p ETCTB-S1和p ETCTB-S2,并将其转入BL21(DE3)大肠杆菌中。实验结果表明:重组表达载体p ETCTB-SAPE、p ETCTB-S1和p ETCTB-S2与设计序列完全一致。3、新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的表达与纯化本研究诱导表达各个肝片吸虫表位疫苗抗原蛋白CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2并经Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。实验结果表明:CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2均可获得高效表达,并且主要以包涵体形式表达;经Ni-NTA亲和层析纯化后得到电泳纯的CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2,为肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特异性研究奠定实验基础。4、新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE免疫原性和免疫特异性的研究本研究通过分子生物学和免疫学等方法来鉴定肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE中各个抗原表位是否保持有其免疫原性和免疫特异性、分子内黏膜佐剂CTB组分与神经节苷脂GM1的结合活性、肝片吸虫多表位肽疫苗CTB-SAPE的免疫原性是否优越于肝片吸虫单表位疫苗(CTB-S1和CTB-S2)。实验结果表明:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE具有良好的免疫原性和免疫特异性,能够激发机体产生特异性的细胞免疫应答和高滴度表位特异性抗体。新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE不同于以往所研制的肝片吸虫疫苗,激发的免疫应答具有更高的免疫针对性和免疫特异性。
【关键词】：肝片吸虫 鞘脂激活蛋白样蛋白 2 表位疫苗
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 主要符号对照表13-14
• 第1章 引言14-17
• 第2章 肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白 2(Fh SAP-2)的原核表达及分离纯化17-27
• 2.1.实验材料17-19
• 2.1.1 质粒和菌株17
• 2.1.2 主要试剂17-19
• 2.1.3 实验仪器19
• 2.2.实验方法19-21
• 2.2.1 Fh SAP-2 序列的获得及优化19-20
• 2.2.2 Fh SAP-2 基因的克隆及鉴定20
• 2.2.3 Fh SAP-2 蛋白的表达及纯化20
• 2.2.4 肝片吸虫总蛋白提取20-21
• 2.3 实验结果21-25
• 2.3.1 Fh SAP-2 序列原核表达系统的优化21-22
• 2.3.2 重组质粒p ET22b-SAP-2 及p ET28a-SAP-2 的鉴定22-23
• 2.3.3 p ET22b-SAP-2 及p ET28a SAP-2 蛋白表达部位鉴定23-24
• 2.3.4 纯化后Fh SAP-2 的SDS-PAGE考察24-25
• 2.4 讨论25-26
• 2.5 结论26-27
• 第3章 新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的设计及重组表达载体的构建27-45
• 3.1.实验材料27-30
• 3.1.1 Fh SAP-2 氨基酸序列27
• 3.1.2 霍乱毒素B亚基（CTB）27-28
• 3.1.3 质粒和菌株28
• 3.1.4 主要试剂28-29
• 3.1.5 主要溶液及配方29
• 3.1.6 实验仪器29-30
• 3.2 实验方法30-35
• 3.2.1 肝片吸虫优势抗原表位的选择30
• 3.2.2 抗原表位连接顺序、重复次数、间隔序列的设计30
• 3.2.3 多表位肽SAPE与霍乱毒素B亚基的偶联设计30-31
• 3.2.4 新型肝片吸虫多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的三级结构分子建模31
• 3.2.5 重组表达载体p ETCTB-SAPE的构建31-33
• 3.2.6 重组表达载体p ETCTB-S1、p ETCTB-S2的构建33-35
• 3.3 实验结果35-43
• 3.3.1 Fh SAP-2 优势抗原表位的选择35
• 3.3.2 新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的设计方案35-37
• 3.3.3 肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE间隔序列设计及三级结构的分子建模37-38
• 3.3.4 重组载体p ETCTB-SAPE的构建38-40
• 3.3.5 重组表达载体p ETCTB-S1、p ETCTB-S2的构建40-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 结论44-45
• 第4章 新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的表达与纯化45-53
• 4.1 实验材料45-47
• 4.1.1 主要试剂45-46
• 4.1.2 主要溶液及配方46
• 4.1.3 实验仪器46-47
• 4.2 实验方法47-49
• 4.2.1 基因工程菌株的诱导表达及鉴定47-48
• 4.2.2 Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化48-49
• 4.2.3 重组蛋白的透析复性和浓缩49
• 4.3 实验结果49-51
• 4.3.1 基因工程菌株的诱导表达及鉴定49-50
• 4.3.2 鞘脂激活蛋白多表位融合蛋白CTB-SAPE的纯化及单表位融合蛋白CTB-S1、CTB-S2的纯化50-51
• 4.4 讨论51-52
• 4.5 结论52-53
• 第5章 新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE免疫原性和免疫特异性的研究53-68
• 5.1 实验材料53-55
• 5.1.1 电泳纯肝片吸虫表位肽融合蛋白53
• 5.1.2 高纯度Fh SAP-2 表位肽蛋白53-54
• 5.1.3 实验动物54
• 5.1.4 主要试剂54-55
• 5.1.5 主要溶液及配方55
• 5.1.6 实验仪器55
• 5.2 实验方法55-57
• 5.2.1 BALB/c小鼠的免疫接种55-56
• 5.2.2 GM1-ELISA56
• 5.2.3 特异性抗体的ELISA检测56-57
• 5.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验57
• 5.3 实验结果57-65
• 5.3.1 Fh SAP-2 表位（Fh SAP22130）特异性抗体的检测57-58
• 5.3.2 Fh SAP-2 表位（Fh SAP27685）特异性抗体的检测58-59
• 5.3.3 Fh SAP-2 表位肽融合蛋白与GM1结合活性的检测59-60
• 5.3.4 肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE免疫组小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的检测60-63
• 5.3.5 肝片吸虫多表位疫苗Ig G1、Ig G2a和Ig A特异性抗体的检测63-64
• 5.3.6 肝片吸虫总蛋白和Fh SAP-2 特异性Ig G抗体检测64-65
• 5.4 讨论65-66
• 5.5 结论66-68
• 全文总结68-70
• 综述70-78
• 参考文献78-86
• 致谢86-88
• 作者简历88-87

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本文编号：292603