folP1与folP2基因在磺胺甲恶唑—甲氧苄啶抗分枝杆菌中的作用机制研究

发布时间：2017-04-08 11:24

  本文关键词：folP1与folP2基因在磺胺甲恶唑—甲氧苄啶抗分枝杆菌中的作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobactrium tuberculosis,Mtb)引起的慢性传染病。耐药TB的出现使得TB成为严重的公共卫生问题和社会问题,现有的抗TB药物已经不能满足需要,新药的研发显得更为迫切。然而新药的研发又需要耗费大量的时间与金钱,如果能利用已经应用于临床的药物来治疗TB,将使得TB药物的研发更加快速、便宜。磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole, SMX)在体内和体外均具有抗TB作用,是治疗耐药TB的候选药物之一。在临床上SMX与甲氧苄啶(trimethoprim, TMP)联合用于治疗细菌引起的呼吸道、泌尿道和胃肠道感染。研究发现SMX与TMP主要作用机制分别是靶向叶酸合成途径中的二氢蝶酸合酶(dihydropteroic acid synthase,DHPS)和二氢叶酸还原酶(dihydrofolic acid, DHFR);但是SMX与TMP在分枝杆菌中的作用机制至今还未被阐明。 本研究旨在探究分枝杆菌中folP1与folP2基因在TMP-SMX抗分枝杆菌中的作用,从而加速以TMP-SMX为基础的抗TB新药的研发。在分枝杆菌中,folP1基因编码DHPS,而folP2基因编码的蛋白与其具有同源性。本研究通过在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, Msm)中分别过表达Mtb和Msm的folP1/2基因及敲除Msm folP2基因,得到重组菌株Msm::p60fp1, Msm::p60fp2, Msm::p60Msfp1, Msm::p60Msfp2和Msm△folP2,再通过固体平板法检测SMX和TMP对这些重组菌株的的最小抑制浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。结果发现在Msm中过表达MtbfolPl基因会使SMX和TMP的MIC都增加4倍；在Msm中过表达Msm folP1基因会使SMX和TMP的MIC都增加2倍。另外,敲除Msm的folP2基因后,SMX对其的MIC降低至野生型Msm的1/8,这可能是由于folP2基因产物的存在减弱了SMX的抑菌效果,暗示了FolP2抑制剂与SMX联用时可能会有较好的抗TB效果。 在本研究中我们也在尝试改进分枝杆菌基因敲除技术。由于Mtb生长缓慢,需要在P3实验室操作等原因,许多已存在的高效率的基因敲除技术都不能应用于Mtb。在过去20年,虽然出现了大量的分枝杆菌基因敲除技术,但这些技术,要么需要通过电转化将DNA转入分枝杆菌体内,要么需要利用噬菌体作为载体将同源的DNA递送到Mtb菌内,然后通过同源重组达到基因敲除的目的。分枝杆菌电转化效率低,再加上同源重组的低效率极大地限制了相关技术在分枝杆菌中的应用,尤其是慢速分枝杆菌。即便是最近引入了重组工程的方法来增强重组效率,利用电转化获得基因敲除株的效率仍然很低；然而构建噬菌体的方法,需要体外包装的步骤,不仅制备昂贵而且受到DNA包装大小的更严格的限制。本研究通过改进的方法将等位交换底物(allelic exchange substrates, AESs)插入分枝杆菌phAE159噬菌体基因组中构建重组噬菌体,进一步通过噬菌体可高效地将AESs引入分枝杆菌中,从而提高基因敲除效率。
【关键词】：分枝杆菌 folP1 folP2 磺胺甲恶唑 甲氧苄啶 基因敲除 噬菌体
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 绪论12-26
• 1.1 结核病概述12-16
• 1.1.1 结核病12
• 1.1.2 Mtb的生物学特性12-13
• 1.1.3 Mtb的致病机制13-14
• 1.1.4 TB的治疗14-15
• 1.1.5 耐药TB的出现15
• 1.1.6 抗TB药物研发15-16
• 1.2 磺胺甲恶唑-甲氧苄啶16-19
• 1.2.1 磺胺甲恶唑-甲氧苄啶的应用16-17
• 1.2.2 TMP-SMX作用机制17
• 1.2.3 TMP-SMX与TB17-19
• 1.3 叶酸合成途径19-21
• 1.3.1 叶酸合成途径的重要性19
• 1.3.2 叶酸合成途径中的DHPS19-20
• 1.3.3 分枝杆菌中的folP1与folP2基因20-21
• 1.4 研究基础21-23
• 1.5 研究意义与方法23
• 1.6 基因敲除技术的研究23-26
• 第二章 实验材料与方法26-48
• 2.1 实验材料26-31
• 2.1.1 实验菌株与质粒26-27
• 2.1.2 实验所用引物27-28
• 2.1.3 主要试剂和耗材28
• 2.1.4 抗生素与药物28-29
• 2.1.5 常用培养基与相关溶液29-30
• 2.1.6 实验仪器30-31
• 2.2 实验方法31-48
• 2.2.1 过表达folP1与folP2基因质粒的构建31-36
• 2.2.2 同源重组质粒的构建36-37
• 2.2.3 重组分枝杆菌的构建37-39
• 2.2.4 folP2基因敲除株的鉴定39-43
• 2.2.5 重组分枝杆菌药物敏感性检测43
• 2.2.6 重组分枝杆菌生长曲线的测定43-44
• 2.2.7 互补实验44
• 2.2.8 耐药菌株的筛选44
• 2.2.9 基因敲除技术的改进与探究44-48
• 第三章 结果与讨论48-60
• 3.1 Mtb药物敏感性检测48
• 3.2 质粒的构建48-50
• 3.2.1 过表达folP1与folP2基因质粒的构建48-50
• 3.2.2 同源重组质粒pblMsfp2LRH的构建50
• 3.3 重组分枝杆菌的构建50-53
• 3.3.1 过表达folP1与folP2基因分枝杆菌的构建50-51
• 3.3.2 Msm folP2基因敲除株的构建51
• 3.3.3 folP2基因敲除株的鉴定51-53
• 3.4 药物敏感性检测53-54
• 3.5 重组分枝杆菌生长曲线的测定54-55
• 3.6 互补实验与耐药菌株的筛选55
• 3.7 基因敲除技术的改进与探究55-57
• 3.7.1 p159LART质粒的构建55
• 3.7.2 质粒pblfp2LRH的构建55-56
• 3.7.3 质粒pblMsfp2LRHA159与pblfp2LRHA159的构建56-57
• 3.7.4 噬粒p159Msfp2LRH与p159fp2LRH的鉴定57
• 3.7.5 噬菌体制备57
• 3.8 讨论57-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-71
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果71

【共引文献】

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