重编程过程中使用抗氧化剂降低人iPSCs基因组变异

发布时间：2017-04-09 13:05

  本文关键词：重编程过程中使用抗氧化剂降低人iPSCs基因组变异，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 人类胚胎干(ES)细胞具有在体外无限增殖和分化为多种细胞的潜能,可为再生医学的替代疗法提供充足的细胞来源。然而由于入ES细胞的分离涉及到伦理问题,从而限制了ES细胞的研究以及在再生医学领域的潜在应用。2006年,日本京都大学山中伸弥(Shinya Yamanaka)团队通过向小鼠皮肤成纤维细胞导入以逆病毒为载体的4个转录因子Oct3/4、SOX2、c-Myc、Klf4,将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)。iPSCs和ES细胞功能类似,可以在体外无限增殖并具有多向分化能力。重编程技术绕开了ES细胞研究一直面临的伦理障碍,在生物学基础研究和临床应用方面具有重大的潜在价值,因而成为了当前生物医学研究的热点。但是,多个小组的研究表明iPSCs的基因组存在变异,基因变异可能使移植的细胞在体内产生肿瘤,从而限制了iPSCs的应用。然而目前关于人iPSCs基因组变异的原因大部分未知。我们的课题证明了人体细胞重编程过程中存在氧化应激,在诱导iPSCs产生过程中的培养基中添加抗氧化剂可以降低人iPSCs基因组的变异。我们的研究结果表明,可通过在诱导产生和维持iPSCs的培养基中添加抗氧化剂来提高人类iPSCs的质量和安全性,从而为获得更安全的iPSCs应用于再生医学提供一定的参考价值。本研究分为两个部分：1)人体细胞重编程诱导成iPSCs系统的建立；2)人体细胞重编程过程中加入抗氧化剂降低iPSCs基因组变异的研究。 第一部分人体细胞重编程系统的建立 目的：建立人类成纤维细胞或者尿液细胞重编程为iPSCs的体系,为研究作用机制提供基础。 方法：重编程四因子OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC以PMX逆转录病毒为载体导入到目的细胞中进行诱导成iPSCs,挑选克隆后继续培养,传代和扩增,并对其进行鉴定如ES细胞特异标记分子的表达和体外细胞分化实验明确获得成熟的iPSCs。 结果：在人尿液来源的细胞和人的皮肤成纤维细胞成功导入重编程四因子后均可观察到明显的细胞形变,经检测为ALP阳性。 结论：通过以逆转录病毒为载体导入特定转录因子的经典方法可以使人尿液来源的细胞和人的皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs. 第二部分体细胞重编程过程中使用抗氧化剂降低基因组变异 目的：人iPSCs的基因组存在变异阻碍iPSCs在生物及医学领域的潜在应用。因此明确导致人iPSCs基因组变异的原因并发明方法以减少其变异,对于获得安全的iPSCs用于再生医学非常重要。本研究旨在探究人体细胞重编程过程中氧化自由基应激是否是导致人iPSCs基因组变异的重要原因,加入抗氧化剂是否可以减少iPSCs基因组变异。 方法：在重编程过程中检测ROS以及DNA损伤水平,并对比加入抗氧化剂后对ROS, DNA损伤和人iPSCs基因组变异的作用。 结果：相对于对照组,添加抗氧化剂可以显著降低ROS和DNA损伤水平,加入抗氧化剂后获得的iPSCs具有较少的基因组拷贝数变异。 结论：添加抗氧化剂可降低人iPSCs基因组的变异。
【关键词】：抗氧化剂 体细胞重编程 基因组变异 诱导多能干细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 缩略词10-14
• 引言14-16
• 1 第一章 iPSCs系统建立16-37
• 1.1 实验试剂与仪器16-21
• 1.1.1 材料和试剂16-17
• 1.1.2 实验仪器及材料17-18
• 1.1.3 相关试剂的配制18-21
• 1.2 实验方法21-29
• 1.2.1 支原体检测21-22
• 1.2.2 人包皮成纤维细胞(HFF)的分离和培养22
• 1.2.3 人尿液细胞(UC)的分离和培养22-23
• 1.2.4 iPSCs细胞的培养23
• 1.2.5 MEF细胞的分离和培养23-24
• 1.2.6 MEF饲养层处理24
• 1.2.7 细胞冻存24
• 1.2.8 细胞复苏24-25
• 1.2.9 重编程步骤方法25
• 1.2.10 感受态细胞的制备25-26
• 1.2.11 质粒转化26
• 1.2.12 质粒大量抽提26-27
• 1.2.13 病毒包装27-28
• 1.2.14 病毒感染28
• 1.2.15 BCIP/NBT碱性磷酸酯酶染色28-29
• 1.3 实验结果29-36
• 1.3.1 获得人诱导多能性干细胞流程图29
• 1.3.2 支原体检测结果29-30
• 1.3.3 成功分离P0代人尿液细胞30-31
• 1.3.4 293T成功转染质粒PMX-GFP31-32
• 1.3.5 pMX-GFP成功感染尿液细胞32-33
• 1.3.6 感染四因子后尿液细胞的形变变化33-34
• 1.3.7 感染四因子后成纤维细胞的形变变化34-35
• 1.3.8 感染四因子后外源因子的表达35
• 1.3.9 ES样细胞出现35-36
• 1.4 讨论36-37
• 2 第二章 体细胞重编程过程中使用抗氧化剂降低基因组变异37-51
• 2.1 材料和试剂37
• 2.1.1 实验仪器及材料37
• 2.1.2 相关试剂配制37
• 2.2 实验方法37-41
• 2.2.1 提取RNA37-38
• 2.2.2 逆转录合成cDNA38
• 2.2.3 实时荧光定量PCR(Real time PCR)38-39
• 2.2.4 γH2AX免疫荧光染色39-40
• 2.2.5 流式细胞术测细胞凋亡40
• 2.2.6 MTT assay40-41
• 2.2.7 Southern Blot测定逆转录病毒整合41
• 2.2.8 其余方法同第一章41
• 2.3 实验结果41-50
• 2.3.1 添加NAC实验流程图41-42
• 2.3.2 添加抗氧化剂对ROS水平、基因损伤和细胞存活的影响42-47
• 2.3.3 添加抗氧化剂对重编程效率的影响47-48
• 2.3.4 添加抗氧化剂对基因组变异的影响48-50
• 2.4 讨论50-51
• 总结51-53
• 参考文献53-56
• 综述56-67
• 参考文献63-67
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果67

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张萍;马月辉;焦淑清;关伟军;;诱导性多能干细胞研究及临床应用[J];动物医学进展;2015年08期

2 徐方平,罗健东;活性氧与心肌细胞凋亡[J];华北国防医药;2003年02期

3 姜文;何庆;;百草枯急性肺损伤中毒机制的研究进展[J];华西医学;2006年03期

4 沈传陆,朱俊;Prx1高表达对人PC3前列腺癌细胞氧化损伤的作用[J];东南大学学报(医学版);2005年06期

5 张先平;张贵海;陈斌;刘俊;魏强;王璐;王亚平;;氧化低密度脂蛋白通过氧化应激诱导小鼠造血干细胞衰老[J];基础医学与临床;2013年02期

6 王含彦;宋永燕;陈建业;;钾离子与血管钙化调节研究进展[J];中华老年心脑血管病杂志;2012年03期

7 王清;宁璇璇;裴东;赵建民;由丽萍;王春艳;吴惠丰;;Molecular cloning, characterization and expression profiles of thioredoxin 1 and thioredoxin 2 genes in Mytilus galloprovincialis[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2013年03期

8 汪涵;陈卓;;转录因子Klf4在人牙髓组织和牙髓成纤维细胞中的表达研究[J];口腔医学;2013年09期

9 XIE ShuJuan;ZHANG Yin;QU LiangHu;XU Hui;;A Helm model for microRNA regulation in cell fate decision and conversion[J];Science China(Life Sciences);2013年10期

10 甘鹏;熊亮;贾文超;潘传英;蓝贤勇;陈宏;;牛c-Myc/TAT/9R融合表达载体构建及其原核表达研究[J];家畜生态学报;2013年10期

中国重要会议论文全文数据库 前8条

1 ;Oxidative Stress and Apoptotic Changes of Rat Cerebral Cortical Neurons Exposed to Cadmium in Vitro[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集（上册）[C];2011年

2 王薇;熊微;万江陵;徐辉碧;杨祥良;;聚乙二醇修饰降低聚酰胺-胺树状大分子细胞毒性的机理研究(英文)[A];第十届中国科协年会论文集（三）[C];2008年

3 陈承志;Xuejun Jiang;Wenwen Deng;Yanan Hu;Zunzhen Zhang;;白藜芦醇对三氧化二砷毒性的保护作用由谷胱甘肽稳态系统和线粒体、死亡受体凋亡的多路径调控(英文)[A];第十一届全国博士生学术年会（生物医药专题）论文集（上册，大会报告）[C];2013年

4 周灿权;李宇彬;;研究中的生殖医学技术[A];中华医学会生殖医学分会第二次全国生殖临床学术研讨会论文汇编[C];2012年

5 张可华;袁宝珠;;治疗性干细胞产品相关的风险因素[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年

6 种朝阳;臧伟进;周筠;;iPSCs在心律失常疾病体外模型方面的研究进展[A];全国第十三届心脏学会、第十六届心功能专业委员会和《心脏杂志》编委会联合学术大会会议纪要[C];2013年

7 蔡杰;李慧;杨焰;荆小莉;魏红艳;胡春林;廖晓星;李欣;;iPS-MSCs通过调节CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ T细胞改善心脏骤停后全身免疫反应[A];《中华急诊医学杂志》第十三届组稿会暨第六届急诊医学青年论坛论文汇编[C];2014年

8 宋媛媛;张宁;尹瑞川;尹俊发;汪海林;;荧光修饰抗坏血酸酯的合成及细胞成像分析[A];第十届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会论文集[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李伟;PP2A抑制剂对胰腺癌细胞生长、转移的抑制作用及机制研究[D];南京医科大学;2010年

2 赵景霞;纳米氧化锌对海马神经元电生理特性的影响及对PC12细胞生物学效应的机制研究[D];南开大学;2010年

3 江筠;莲藕中抗氧化成分的抗HIV-1活性及其作用机制研究[D];南开大学;2010年

4 漆永梅;错配修复蛋白hMLH1在硒化合物诱导DNA损伤应答途径中的作用[D];兰州大学;2011年

5 蒋伟忠;基于危险度分层差异的胃肠间质瘤比较蛋白质组学研究[D];福建医科大学;2011年

6 孙国贵;锰超氧化物歧化酶表达特性与食管癌关系的临床基础研究[D];河北医科大学;2011年

7 赵延涛;LPS致流产作用及保胎中药的调控效应研究[D];河北农业大学;2011年

8 周鑫才;等离子体射流联合刮治术治疗犬种植体周围炎的实验研究[D];华中科技大学;2012年

9 李建明;线粒体在活性氧诱导肠上皮细胞凋亡中的作用[D];第三军医大学;2002年

10 胡宇;砷诱导NIH3T3细胞转化分子机制的体外实验研究[D];新疆医科大学;2002年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邹鑫森;27例百草枯中毒的临床分析[D];广西医科大学;2011年

2 王牡;姜黄素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究[D];暨南大学;2011年

3 许小萍;氧化应激在罗哌卡因所致大鼠脊髓神经毒性中的作用及其机制[D];中南大学;2011年

4 郭成志;三聚氰胺致NRK-52e细胞氧化应激与p38MAPK通路介导细胞凋亡的研究[D];湖南农业大学;2011年

5 张丽;白花丹素对黑素瘤A375细胞体外增殖及凋亡的影响[D];华中科技大学;2010年

6 刘冠兰;萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化功能研究[D];清华大学;2010年

7 朱昱燕;不同非生物因子对大久保桃果实采后品质以及活性氧代谢的影响[D];北京工商大学;2010年

8 王伟;百草枯中毒致肺纤维化病变区域分布的影像学研究[D];第四军医大学;2011年

9 孟焕成;百草枯中毒机制及治疗进展[D];第四军医大学;2011年

10 李峰;小麦—条锈菌互作过程中的活性氧和Ca~(2+)功能的研究[D];西北农林科技大学;2011年

  本文关键词：重编程过程中使用抗氧化剂降低人iPSCs基因组变异，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：295294