抗c-Myc纳米抗体的淘

发布时间：2017-04-09 14:03

  本文关键词：抗c-Myc纳米抗体的淘选、表达及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞中,存在着一类基因或者是基因家族,其在通常情况下为抑制状态或维持较低表达水平,当其在某些因素作用下,基因表达失去控制,细胞的正常生物学性状会发生各种改变,逐步转化成为恶性细胞,最终导致细胞甚至机体癌变。这类基因我们通常称之为原癌基因(Proto-oncogene)。myc基因家族为原癌基因家族中的一类,主要分为c-myc、n-myc、l-myc三类基因。myc基因家族及其产物主要与调控细胞周期的DNA结合,控制细胞的增殖以及诱导细胞的凋亡。研究认为,肿瘤的发生与转移同c-myc基因的激活有密切关系。量子点(QDs)是由II-VI族或III-V族元素组成的半导体材料,属于纳米晶体,受激后能发射荧光,可用于生物学分析。量子点激发光谱宽,同时发射光谱窄并且左右对称,可以通过改变粒子大小控制荧光发射波长。与传统有机荧光染料相比,量子点具有很高的量子产率和抗光漂白能力,而且荧光寿命长,具有良好的生物相容性。因此,量子点荧光技术在生物学领域具有广阔前景。本研究采用噬菌体展示技术,从羊驼免疫库中淘选能与c-Myc结合的纳米抗体,并将淘选获得的抗c-Myc纳米抗体在大肠杆菌中进行表达,纯化的重组抗c-Myc纳米抗体经量子点标记后,初步用于检测细胞内c-Myc蛋白的表达情况,主要研究结果如下:1、通过四轮固相淘选,从羊驼c-Myc蛋白免疫文库中获得了了11个能特异性结合c-Myc蛋白的克隆,分别为A13、A18、A25、A26、A31、A32、B34、C5、C24、C42、C46,并对这些克隆的亲和力大小进行了分析比较。2、选取亲和力相对较高的克隆(A25和A26),分别将编码基因克隆至表达载体pET-25b(+),在大肠杆菌表达系统中,使用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白分子量约20 kDa,与预期分子大小相符。3、初步验证了利用量子点标记重组纳米抗体用于细胞内靶标检测的方法。制备SP2/0细胞爬片,用量子点荧光标记纳米抗体,检测c-Myc蛋白在细胞内表达,加入纳米抗体及量子点后,细胞显示荧光,单纯加入量子点,无荧光反应,本研究得到的纳米抗体有望实现对细胞内c-Myc蛋白表达情况检测。
【关键词】：纳米抗体 c-Myc ELISA 量子点
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩略语6-12
• 第1章 前言12-23
• 1.1 原癌基因myc概况12-17
• 1.1.1 原癌基因12
• 1.1.2 原癌基因分类12-13
• 1.1.3 myc基因的结构与功能13-15
• 1.1.4 c-Myc蛋白的作用机制15-17
• 1.1.5 c-myc与肿瘤17
• 1.2 c-myc在检测中的研究进展17-19
• 1.2.1 基于c-myc基因的检测方法17-18
• 1.2.2 基于c-Myc蛋白的检测方法18
• 1.2.3 c-Myc作为蛋白融合标签的应用18-19
• 1.3 量子点概述19-22
• 1.3.1 量子点定义19
• 1.3.2 量子点光学特征19-20
• 1.3.3 量子点在生物学检测中的应用20-22
• 1.4 主要研究内容及意义22-23
• 1.4.1 主要研究内容22
• 1.4.2 研究意义22-23
• 第2章 抗c-Myc纳米抗体的淘选及鉴定23-36
• 2.1 实验试剂与仪器23-25
• 2.1.1 实验试剂23-24
• 2.1.2 溶液配制24-25
• 2.1.3 实验仪器25
• 2.2 方法与步骤25-29
• 2.2.1 辅助噬菌体M13K07滴度测定及扩增25-26
• 2.2.2 抗c-Myc蛋白抗体噬菌体文库的淘选26-28
• 2.2.3 阳性噬菌体的鉴定及分析28-29
• 2.3 结果与分析29-34
• 2.3.1 抗c-Myc蛋白抗体的亲和淘选29-31
• 2.3.2 阳性噬菌体的鉴定31-33
• 2.3.3 阳性噬菌体的序列分析33-34
• 2.4 讨论与小结34-36
• 2.4.1 讨论34-35
• 2.4.2 小结35-36
• 第3章 抗c-Myc纳米抗体的诱导表达及活性初探36-54
• 3.1 实验试剂与仪器36-38
• 3.1.1 实验试剂36-37
• 3.1.2 溶液配制37-38
• 3.1.3 实验仪器38
• 3.2 方法与步骤38-47
• 3.2.1 阳性噬菌体相对亲和力的比较38-39
• 3.2.2 质粒的提取39
• 3.2.3 电转感受态细胞的制备39-40
• 3.2.4 pET25b-Myc表达载体的构建40-43
• 3.2.5 抗c-Myc纳米抗体的诱导表达43-44
• 3.2.6 SDS-PAGE电泳检测抗体蛋白的表达44-45
• 3.2.7 抗体蛋白表达条件的优化45
• 3.2.8 抗体蛋白的活性分析45-47
• 3.3 结果与分析47-52
• 3.3.1 阳性噬菌体相对亲和力的比较47
• 3.3.2 获得目的基因47-49
• 3.3.3 构建pET25-Myc表达载体49-50
• 3.3.4 目的蛋白的诱导表达50
• 3.3.5 目的蛋白活性的鉴定50-51
• 3.3.6 目的蛋白表达条件的优化51-52
• 3.4 讨论与小结52-54
• 3.4.1 讨论52-53
• 3.4.2 小结53-54
• 第4章 量子点荧光技术检测细胞内myc蛋白表达初探54-62
• 4.1 实验试剂与仪器54-55
• 4.1.1 实验试剂54-55
• 4.1.2 溶液配制55
• 4.2 方法与步骤55-57
• 4.2.1 细胞爬片制备55-56
• 4.2.2 量子点间接免疫荧光法对细胞内myc蛋白检测56
• 4.2.3 量子点直接免疫荧光法对细胞内myc蛋白检测56-57
• 4.3 结果与分析57-60
• 4.3.1 量子点间接免疫荧光法对胞内myc蛋白特异性标记57-59
• 4.3.2 量子点直接免疫荧光法对胞内myc蛋白特异性标记59-60
• 4.4 讨论与小结60-62
• 4.4.1 讨论60-61
• 4.4.2 小结61-62
• 第5章 主要研究结果与展望62-63
• 5.1 主要研究结果62
• 5.2 进一步工作方向62-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 孔波;刘惠;杨胜利;马维骏;;大分子量重组蛋白在丝状噬菌体表面的展示表达及其与小分子相互作用的初步研究[J];生物工程学报;2006年01期

2 江汉民;柴新君;何冰;赵娟;俞新大;;ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性[J];生物工程学报;2008年03期

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