铜绿假单胞菌flgE基因PCR检测方法的初步建立
发布时间：2021-01-15 02:31
为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。
【文章来源】：现代畜牧兽医. 2020,(03)
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
PCR反应循环次数优化结果M：DNAMarkerDL2000；1～7：循环次数分别为
现代畜牧兽医2020年第3期M：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L图4Mg2+浓度优化结果Fig.4OptimizationofMg2+concentrationM：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24mmol/L图5dNTPs浓度的优化结果Fig.5OptimizationofdNTPsconcentration22.6引物浓度优化结果将反应体系中的引物浓度分别设置为0～0.6μmol/L，进行PCR扩增，结果如图6所示。当反应体系中不含引物时未扩增出目的条带，反应体系中的引物浓度为0.2～0.6μmol/L时均有目的条带出现，且随着引物浓度的增加条带亮度逐渐增加，但当引物浓度增加至0.3μmol/L时条带亮度几乎不再变化，而当引物浓度为0.6μmol/L时条带亮度又有所下降，因此将flgE基因PCR扩增时的最佳引物浓度设置为0.3μmol/L。22.7特异性试验结果分别以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以本试验设计的铜绿假单胞菌flgE基因的PCR引物进行扩增，对扩增产物进行电泳分析，结果如图7所示。仅当以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增时出现了与预期大小一致的目的条带，而当以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板时均未扩增到目的条带，表明本试验建立的基于flgE基因的铜绿假单胞菌PCR检测方法具有良好的特异性。M：DNAMarkerDL2000；1～6：以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和致病性大肠杆菌基因组DNA为模板时的扩增结果；7：阴性对照图7特异性试验结果Fig.7Resultofspecificitytest22.8敏感性试验结果将铜绿假单胞菌基因组DNA
现代畜牧兽医2020年第3期M：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L图4Mg2+浓度优化结果Fig.4OptimizationofMg2+concentrationM：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24mmol/L图5dNTPs浓度的优化结果Fig.5OptimizationofdNTPsconcentration22.6引物浓度优化结果将反应体系中的引物浓度分别设置为0～0.6μmol/L，进行PCR扩增，结果如图6所示。当反应体系中不含引物时未扩增出目的条带，反应体系中的引物浓度为0.2～0.6μmol/L时均有目的条带出现，且随着引物浓度的增加条带亮度逐渐增加，但当引物浓度增加至0.3μmol/L时条带亮度几乎不再变化，而当引物浓度为0.6μmol/L时条带亮度又有所下降，因此将flgE基因PCR扩增时的最佳引物浓度设置为0.3μmol/L。22.7特异性试验结果分别以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以本试验设计的铜绿假单胞菌flgE基因的PCR引物进行扩增，对扩增产物进行电泳分析，结果如图7所示。仅当以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增时出现了与预期大小一致的目的条带，而当以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板时均未扩增到目的条带，表明本试验建立的基于flgE基因的铜绿假单胞菌PCR检测方法具有良好的特异性。M：DNAMarkerDL2000；1～6：以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和致病性大肠杆菌基因组DNA为模板时的扩增结果；7：阴性对照图7特异性试验结果Fig.7Resultofspecificitytest22.8敏感性试验结果将铜绿假单胞菌基因组DNA
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测[J]. 赵冠宇,解长占,孙文超,张赫,那少龙,李卓昕,张涵,李成辉,哈卓,李金凤,韩继成,南福龙,庄忻雨,张英,金宁一. 中国兽医学报. 2019(10)
[2]乙型肝炎病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立与评价[J]. 夏乔,廖丽丽,董志强,杨鸿辉,蒋析文. 分子诊断与治疗杂志. 2019(05)
[3]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用[J]. 杨永能. 中国猪业. 2019(06)
[4]猪重要病毒性病原多重PCR检测方法建立及应用[J]. 王朋冲,姜艳芬,周宏超,李春燕,李鑫鑫,罗丽华,冯秀,郭抗抗. 中国兽医杂志. 2019(06)
[5]胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用[J]. 唐虹,徐仲兰,孔科,唐海燕,范正杨,焦新安,黄金林. 中国人兽共患病学报. 2019(08)
[6]禽4种常见细菌病多重PCR检测方法的初步研究[J]. 宫强,李战丽,牛明福. 黑龙江畜牧兽医. 2018(09)
[7]食品中铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测的研究[J]. 杨滴,刘彦泓,刘岑杰,夏元凤. 食品研究与开发. 2017(21)
[8]铜绿假单胞菌重要外毒素基因多重PCR检测方法的建立[J]. 石慧,程国灵,许文涛,罗云波. 中国食品学报. 2015(11)
[9]水貂绿脓杆菌PCR检测方法的建立[J]. 高文玉,樊兆斌,姜莉莉. 黑龙江畜牧兽医. 2013(09)
本文编号：2978044
【文章来源】：现代畜牧兽医. 2020,(03)
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
PCR反应循环次数优化结果M：DNAMarkerDL2000；1～7：循环次数分别为
现代畜牧兽医2020年第3期M：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L图4Mg2+浓度优化结果Fig.4OptimizationofMg2+concentrationM：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24mmol/L图5dNTPs浓度的优化结果Fig.5OptimizationofdNTPsconcentration22.6引物浓度优化结果将反应体系中的引物浓度分别设置为0～0.6μmol/L，进行PCR扩增，结果如图6所示。当反应体系中不含引物时未扩增出目的条带，反应体系中的引物浓度为0.2～0.6μmol/L时均有目的条带出现，且随着引物浓度的增加条带亮度逐渐增加，但当引物浓度增加至0.3μmol/L时条带亮度几乎不再变化，而当引物浓度为0.6μmol/L时条带亮度又有所下降，因此将flgE基因PCR扩增时的最佳引物浓度设置为0.3μmol/L。22.7特异性试验结果分别以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以本试验设计的铜绿假单胞菌flgE基因的PCR引物进行扩增，对扩增产物进行电泳分析，结果如图7所示。仅当以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增时出现了与预期大小一致的目的条带，而当以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板时均未扩增到目的条带，表明本试验建立的基于flgE基因的铜绿假单胞菌PCR检测方法具有良好的特异性。M：DNAMarkerDL2000；1～6：以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和致病性大肠杆菌基因组DNA为模板时的扩增结果；7：阴性对照图7特异性试验结果Fig.7Resultofspecificitytest22.8敏感性试验结果将铜绿假单胞菌基因组DNA
现代畜牧兽医2020年第3期M：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L图4Mg2+浓度优化结果Fig.4OptimizationofMg2+concentrationM：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24mmol/L图5dNTPs浓度的优化结果Fig.5OptimizationofdNTPsconcentration22.6引物浓度优化结果将反应体系中的引物浓度分别设置为0～0.6μmol/L，进行PCR扩增，结果如图6所示。当反应体系中不含引物时未扩增出目的条带，反应体系中的引物浓度为0.2～0.6μmol/L时均有目的条带出现，且随着引物浓度的增加条带亮度逐渐增加，但当引物浓度增加至0.3μmol/L时条带亮度几乎不再变化，而当引物浓度为0.6μmol/L时条带亮度又有所下降，因此将flgE基因PCR扩增时的最佳引物浓度设置为0.3μmol/L。22.7特异性试验结果分别以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以本试验设计的铜绿假单胞菌flgE基因的PCR引物进行扩增，对扩增产物进行电泳分析，结果如图7所示。仅当以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增时出现了与预期大小一致的目的条带，而当以多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板时均未扩增到目的条带，表明本试验建立的基于flgE基因的铜绿假单胞菌PCR检测方法具有良好的特异性。M：DNAMarkerDL2000；1～6：以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和致病性大肠杆菌基因组DNA为模板时的扩增结果；7：阴性对照图7特异性试验结果Fig.7Resultofspecificitytest22.8敏感性试验结果将铜绿假单胞菌基因组DNA
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测[J]. 赵冠宇,解长占,孙文超,张赫,那少龙,李卓昕,张涵,李成辉,哈卓,李金凤,韩继成,南福龙,庄忻雨,张英,金宁一. 中国兽医学报. 2019(10)
[2]乙型肝炎病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立与评价[J]. 夏乔,廖丽丽,董志强,杨鸿辉,蒋析文. 分子诊断与治疗杂志. 2019(05)
[3]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用[J]. 杨永能. 中国猪业. 2019(06)
[4]猪重要病毒性病原多重PCR检测方法建立及应用[J]. 王朋冲,姜艳芬,周宏超,李春燕,李鑫鑫,罗丽华,冯秀,郭抗抗. 中国兽医杂志. 2019(06)
[5]胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用[J]. 唐虹,徐仲兰,孔科,唐海燕,范正杨,焦新安,黄金林. 中国人兽共患病学报. 2019(08)
[6]禽4种常见细菌病多重PCR检测方法的初步研究[J]. 宫强,李战丽,牛明福. 黑龙江畜牧兽医. 2018(09)
[7]食品中铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测的研究[J]. 杨滴,刘彦泓,刘岑杰,夏元凤. 食品研究与开发. 2017(21)
[8]铜绿假单胞菌重要外毒素基因多重PCR检测方法的建立[J]. 石慧,程国灵,许文涛,罗云波. 中国食品学报. 2015(11)
[9]水貂绿脓杆菌PCR检测方法的建立[J]. 高文玉,樊兆斌,姜莉莉. 黑龙江畜牧兽医. 2013(09)
本文编号：2978044
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