家蝇CCTζ基因的cDNA克

发布时间：2017-04-14 00:19

  本文关键词：家蝇CCTζ基因的cDNA克隆、表达及表达模式研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:从家蝇的EST测序数据库中筛选获得家蝇的CCT(chaperonin containing t-complex polypeptide)基因MD-CCTζ,上传Gen Bank分析分子特性后,进行c DNA克隆、表达;探讨MD-CCTζ基因在家蝇不同组织和发育时期的时空表达模式;初步研究在不同病原微生物和热胁迫条件下家蝇3龄幼虫的MD-CCTζ基因表达谱的变化。方法:1、MD-CCTζ的序列分析及c DNA克隆、表达。从课题组前期构建的家蝇幼虫EST数据库中筛选得到家蝇的CCTζ基因序列,通过序列分析,预测其开放阅读框,采用BLAST、EXPASY等生物信息学网站分析预测MD-CCTζ基因编码蛋白的结构域,二级及三级结构等;从NCBI上下载其他物种CCTζ基因的氨基酸序列,借助MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统进化树;根据其c DNA序列设计引物,PCR扩增MD-CCTζ基因,将目的基因与表达载体PEASY-E1构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,选择合适温度、时间使用IPTG诱导重组蛋白,重组蛋白使用His·Tag融合蛋白试剂盒纯化。2、家蝇CCTζ基因的时空表达分析。分别收集家蝇生活史各发育阶段不同虫态(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹),成虫不同性别(雌虫和雄虫)的虫体,提取总RNA后并逆转录为c DNA,以GAPDH基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)技术检测MD-CCTζ基因不同发育时期的表达差异;解剖家蝇3龄幼虫,选择幼虫的六种具有典型特征的组织器官(脂肪体、唾液腺、中肠、气管、马氏管和体壁)。提取相应组织的总RNA并转录为c DNA。采用Real Time PCR检测MD-CCTζ基因的空间表达差异。3、MD-CCTζ基因在家蝇3龄幼虫胁迫条件下的功能初探。分别将定量的不同病原微生物(白色念珠菌、大肠杆菌和及金黄色葡萄球菌)采用注射法导入到家蝇3龄幼虫体内,采用Real Time PCR检测诱导后不同时间点(3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h)CCTζ基因表达水平的变化。将3龄幼虫42℃热胁迫,采用Real Time PCR检测胁迫(0h、15min、30min、1h、1.5h、2h)后不同时间点MD-CCTζ基因表达水平的变化。结果:1、生物信息学分析结果显示,MD-CCTζ的ORF框全长1596 bp,编码一个含531个氨基酸的蛋白多肽,理论分子量为58260.47Da,等电点为6.56;无信号肽和跨膜结构域,有2个CCT蛋白标签,具有CCT的功能结构域,MD-CCTζ的三级结构有多个α螺旋和β折叠,通过不规则卷曲相连,进化树比对分析与地中海实蝇CCT的遗传距离较近。成功构建了MD-CCTζ表达载体,经IPTG诱导,重组蛋白获得表达,并得到纯化蛋白。2、MD-CCTζ基因在家蝇体内的时空表达模式结果显示,在家蝇卵、各龄幼虫、蛹和雌雄成虫各阶段中,MD-CCTζ基因有不同程度的表达。MD-CCTζ基因在卵期表达量最高,其表达水平排列为卵雌虫2龄幼虫1龄幼虫蛹雄虫3龄幼虫。3、家蝇3龄幼虫的各主要组织中,MD-CCTζ基因在唾液腺和气管中的表达水平明显比体壁、脂肪体、中肠和马氏管高,MD-CCTζ基因在各组织表达量为:唾液腺气管马氏管中肠脂肪体体壁。4、大肠杆菌诱导后MD-CCTζ在3h开始轻微上调,到6h、18h、36h出现下调,在12h、24h、48h为上调状态,24h表达量最高。金黄色葡萄球菌、白色念珠菌诱导后在24h表达量最高,其它时间点MD-CCTζ基因表达趋于基础免疫状态。5、家蝇3龄幼虫在热胁迫条件下的MD-CCTζ基因在15min后上调,在2h显著上调表达。结论:1、本研究成功对MD-CCTζ基因分子特性进行了分析、克隆并表达了MD-CCTζ基因,得到了体外重组蛋白。2、初步揭示了MD-CCTζ基因在家蝇体内的时空表达模式,提示MD-CCTζ基因在家蝇生长发育过程中具有重要作用。3、MD-CCTζ基因在家蝇幼虫受到病原微生物及热胁迫后表达量明显上调,提示MD-CCTζ基因参与了家蝇的抗胁迫过程,与家蝇幼虫抵抗外界不利环境有直接关系。
【关键词】：家蝇 CCT 分子特性 克隆表达 表达模式
【学位授予单位】：贵阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R384.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 英文缩略词表10-11
• 引言11-14
• 第一部分14-34
• 材料与方法14-22
• 结果22-32
• 讨论32-34
• 第二部分34-48
• 材料与方法34-38
• 结果38-46
• 讨论46-48
• 参考文献48-52
• 综述52-61
• 参考文献57-61
• 作者简历61-62
• 致谢62-63
• 学位论文数据集63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 聂忠清;吴永刚;蒙建洲;;分子伴侣的功能和应用[J];生命科学;2006年01期

2 韩丁培;王蒲雄志;瞿顺;陈雪华;宗雅萍;冯波;陆爱国;郑民华;;伴侣蛋白CCT6A参与结肠癌细胞迁移及侵袭的作用研究[J];外科理论与实践;2011年04期

3 魏洪;吴建伟;王硕石;国果;付萍;;家蝇幼虫血淋巴提取物抗肿瘤作用[J];中国公共卫生;2013年02期

  本文关键词：家蝇CCTζ基因的cDNA克隆、表达及表达模式研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304808