HCV核心蛋白抑制LPS诱导巨噬细胞产生IFN-γ的机制研究

发布时间：2017-04-14 00:12

  本文关键词：HCV核心蛋白抑制LPS诱导巨噬细胞产生IFN-γ的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科肝炎病毒属。尽管机体免疫系统通过多种途径识别并清除HCV及病毒蛋白,但仍有部分患者在急性感染期不能有效清除病毒,发展为慢性感染,提示HCV可通过多种机制来逃逸宿主的免疫攻击。HCV核心蛋白不仅构成病毒核衣壳、参与病毒复制和组装,还与免疫细胞表面或者胞内蛋白相互作用,诱导驯化免疫细胞,为其提供合适的生存环境。有研究发现,HCV核心蛋白与补体受体(globular heads of C1q receptor,g C1q R)结合,不仅抑制IL-12产生,还干扰T细胞受体(T cell receptor,TCR)活化信号通路,抑制抗病毒免疫应答;或者通过与JAK/STAT信号通路的多种成分相互作用,影响IFN-α的产生,从而抑制抗病毒基因干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的活化。单核/巨噬细胞是机体发挥抗感染的第一道防线,其中单核细胞约占外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的1-6%,趋化至肝内感染部位,分化为巨噬细胞和枯否氏细胞。大量研究结果表明,单核/巨噬细胞在HCV感染后的疾病进程中发挥重要作用。在HCV感染机体早期,单核/巨噬细胞可辅助HCV病毒的复制和持续感染的建立。Gyongyi Szabo等对慢性HCV感染患者的肝组织进行病理学分析,发现肝组织内大量活化的巨噬细胞浸润。本室前期研究发现HCV核心蛋白、肝细胞共同作用可使巨噬细胞表达M2型分子CD206升高。同时后续实验证明了HCV核心蛋白通过与巨噬细胞表面补体受体g C1q R结合,诱导负调控因子A20高表达及炎症因子的低度分泌。因此,本研究拟通过检测胞内信号通路间相互作用观察HCV核心蛋白对LPS诱导巨噬细胞分泌IFN-γ的影响,并初步探讨其机制,为进一步系统阐述HCV核心蛋白对巨噬细胞活性的影响提供实验依据。方法:1人单核细胞THP-1经PMA(15ng/ml)诱导分化为巨噬细胞,命名为m THP-1细胞。以不同浓度HCV核心蛋白(1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)分别作用不同来源巨噬细胞m THP-1和RAW264.70.5h,Western blot检测胞内转录因子NF-κB Phospho-P65和PhosphoERK变化情况。同时以PBS组做为阴性对照组,LPS(1μg/ml)组作为阳性对照组。并确定HCV核心蛋白作用的最适浓度为5μg/ml。2 HCV核心蛋白(5μg/ml)和LPS以不同分组方式分别作用m THP-1、RAW264.7和BMDM细胞6h,收集细胞;采用qRT-PCR检测细胞因子IFN-γm RNA的表达变化,流式细胞术胞内染色法检测RAW264.7细胞表达IFN-γ蛋白的变化。同时设PBS作用组和LPS作用组分别做为阴性和阳性对照组,HCV核心蛋白作用组及HCV核心蛋白+LPS共同作用组为实验组。3应用NF-κB通路阻断剂JSH-23(10μM)预处理RAW264.7细胞1h后,加入LPS(1μg/ml)再次作用细胞6h,收集细胞,采用qRT-PCR和流式细胞术胞内染色法检测IFN-γm RNA和蛋白的表达变化。4 HCV核心蛋白(5μg/ml)和LPS(1μg/ml)以不同分组方式分别作用m THP-1、RAW264.7和BMDM细胞0.5h后,Western blot检测不同细胞的信号通路分子p-P65、p-P105、p-ERK、p-JNK和p-P38的表达变化。实验组及对照组同2。5不同浓度的HCV核心蛋白(1μg/ml、3μg/ml和5μg/ml)和LPS(1μg/ml)共同作用RAW264.7细胞0.5h后,Western blot检测细胞信号通路分子p-P65、p-P105和p-ERK的变化情况。设PBS组和LPS组为对照组。6以ERK通路阻断剂PD98059(10μM、25μM和50μM)预处理RAW264.7细胞1h后,加入LPS(1μg/ml)作用0.5h后,Western blot检测p-ERK表达变化,确定抑制剂使用的最佳浓度为50μM。7应用ERK阻断剂PD98059预处理RAW264.7细胞1h后,加入LPS(1μg/ml)和HCV(5μg/ml)核心蛋白继续作用0.5h或者6h后分别收集细胞,采用Western blot和qRT-PCR检测胞内信号通路分子NF-κB p-P65、p-P105和IFN-γm RNA的表达变化。同时设PBS组和LPS组为对照组。8分别应用JNK阻断剂SP600125和P38阻断剂SB203580预处理RAW264.7细胞1h后,加入LPS(1μg/ml)和HCV核心蛋白(5μg/m l)继续作用6h后分别收集细胞,采用qRT-PCR检测IFN-γm RNA的表达变化。同时设PBS组和LPS组为对照组。结果:1 HCV核心蛋白抑制LPS诱导巨噬细胞产生IFN-γqRT-PCR检测m THP-1、RAW264.7及BMDM三种细胞表达IFN-γm RNA的水平,与LPS组相比,HCV核心蛋白+LPS共同作用组细胞表达IFN-γm RNA水平均显著降低(P0.05)。同时采用流式细胞术胞内染色法检测RAW264.7细胞在不同刺激剂作用下IFN-γ蛋白的表达变化,与qRT-PCR结果一致。2 LPS通过活化NF-κB通路诱导巨噬细胞产生IFN-γ应用NF-κB通路阻断剂JSH-23预处理RAW264.7细胞后,与未加阻断剂的阳性对照组相比,LPS作用巨噬细胞IFN-γm RNA表达显著降低(P0.05)。流式细胞术胞内染色法检测的结果与荧光定量PCR结果一致,与未加阻断剂的阳性对照组相比,JSH-23预处理细胞后LPS组IFN-γ阳性细胞数明显减少。3 HCV核心蛋白抑制LPS诱导巨噬细胞P65和P105的磷酸化Western blot结果显示,LPS和HCV核心蛋白作用m THP-1、RAW264.7及BMDM细胞后,与PBS组比较,LPS组NF-κB p-P65和p-P105升高;与LPS组相比,在HCV核心蛋白+LPS组中,NF-κB pP65和p-P105表达降低。应用不同浓度HCV核心蛋白与LPS共同作用RAW264.7细胞,Western blot结果显示,随着HCV核心蛋白浓度升高,细胞内的NF-κB p-P65和p-P105的表达水平减少,提示HCV核心蛋白抑制被LPS诱导的NF-κB p-P65和p-P105的表达具有浓度依赖性。4 HCV核心蛋白和LPS均可诱导巨噬细胞P65和ERK的磷酸化以不同浓度HCV核心蛋白刺激m THP-1和RAW264.7细胞,使用Western blot方法检测胞内p-P65和p-ERK表达变化,与PBS组比较,LPS组细胞p-P65和p-ERK明显升高;虽然HCV核心蛋白也可引起pP65和p-ERK升高,但是活化程度弱于单独LPS刺激组。5 HCV核心蛋白不能抑制LPS诱导巨噬细胞ERK的磷酸化Western blot结果显示,与LPS组比较,LPS+HCV核心蛋白共同作用组细胞p-ERK的表达水平无明显降低。应用不同浓度HCV核心蛋白与LPS共同作用RAW264.7细胞,Western blot结果显示,随着HCV核心蛋白浓度升高,细胞的p-ERK的表达水平无明显降低。6 HCV核心蛋白通过活化ERK通路抑制LPS诱导巨噬细胞NF-κB通路的活化和IFN-γm RNA表达的升高应用PD98059阻断ERK通路后,与LPS组比较,HCV核心蛋白+LPS共同作用组胞内NF-κB p-P65和p-P105表达无明显差异,并且两组间IFN-γm RNA的表达也无明显差异。7 HCV核心蛋白不能通过JNK或P38通路抑制LPS诱导巨噬细胞IFN-γm RNA表达的升高Western blot结果显示,与LPS组比较,LPS+HCV核心蛋白共同作用组细胞p-JNK和p-P38的表达水平无明显降低。分别应用JNK阻断剂SP600125和P38阻断剂SB203580阻断JNK和P38通路后,与LPS组比较,HCV核心蛋白+LPS共同作用组胞内IFN-γm RNA的表达仍显著降低(P0.05)。结论:1 HCV核心蛋白抑制LPS诱导巨噬细胞产生IFN-γ。2 HCV核心蛋白可通过活化ERK通路抑制LPS诱导巨噬细胞产生IFN-γ。
【关键词】：丙型肝炎病毒核心蛋白 巨噬细胞 干扰素 核转录因子κB ERK
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-28
• 结果28-30
• 附图30-39
• 讨论39-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 综述 在HCV感染过程中固有免疫细胞间的相互作用47-72
• 参考文献57-72
• 致谢72-73
• 个人简历73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Hui-Chun Li;Hsin-Chieh Ma;Chee-Hing Yang;Shih-Yen Lo;;Production and pathogenicity of hepatitis C virus core gene products[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

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本文编号：304782