DNA四面体探针电化学生物传感器检测甲型H7N9流感病毒的研究

发布时间：2017-04-15 22:30

  本文关键词：DNA四面体探针电化学生物传感器检测甲型H7N9流感病毒的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：2013年初，甲型H7N9流感病毒首例呼吸道感染者在我国被发现以来，至今在国内外仍有零星病发，曾一度引起严重的社会恐慌，对经济、社会的发展造成了一定程度的影响。同时，，通过基因突变或重组，甲型H7N9流感病毒具备高感染性并在适合条件下进行大规模流行的可能性仍难以避免。而流感病毒传统的检测方法都需要较为复杂的样品前处理过程，费时费力，价格昂贵。因此开发优于传统检测方法的甲型H7N9流感病毒现场快速检测技术，对甲型H7N9流感病毒的预防和控制都具有非常重要的意义。 DNA电化学生物传感器可以特异性识别病原微生物的核酸序列，从基因水平上实现对病原体的检测和诊断，具备快速、灵敏、成本低、易于自动化和便携化等优点，还有对目标物实现实时多重检测的潜能，使其在病原体检测方面成为最具有应用前景的一类生物传感器。 DNA四面体结构是通过巧妙的DNA序列设计，应用互补配对的原则，各链自动杂交结合而成的具有四面体形状的DNA三维纳米结构分子。DNA四面体探针（TEP, DNATetrahedral Probe）是在四面体的三个顶点上修饰巯基并通过Au-S键固定在电极表面，在另外一个顶点处延伸出一段特异性ssDNA作为探针实现对目标序列的识别结合。作为探针，基于DNA纳米技术自组装的DNA四面体结构纳米材料的表面效应、方位效应和内部的孔隙效应能促其进对目标序列的有效识别与结合，显著提高电子扩散和传递效率，在DNA电化学生物传感器检测方面具有很大的应用潜能。基于DNA四面体探针的电化学生物传感器，已经开展了部分人工合成核酸序列和其他生物分子检测的基础研究，但是目前仍然没有关于使用TEP DNA电化学传感器检测传染病实际样本的报道。其中，如何快速地获取核酸检测目标序列、减少对PCR的依赖、降低背景干扰等，从而实现对传染病病原简单、灵敏、准确、快速的检测仍然有待研究解决。 以对甲型H7N9流感病毒的检测防控为目的，本文构建了一种基于TEP的DNA电化学生物传感器（TEP传感器）用于甲型H7N9流感病毒核酸样本的检测，在基因水平上实现对甲型H7N9流感病毒简便、快速、灵敏、特异的检测，主要研究方法和成果如下： 1.根据WHO公开的编码甲型H7N9流感病毒血凝素蛋白（HA）的特异性保守核酸序列片段，设计出了用于TEP合成的四条ssDNA序列。PAGE凝胶电泳定性分析和TotalLab程序定量分析结果显示，使用简单的一步热变性便可成功合成DNA四面体结构探针，合成效率高达96%。 2.将合成的TEP通过Au-S键的方式固定在工作金电极表面，以目标序列为媒介，固定在金电极表面的四面体探针与引入的生物素修饰的ssDNA检测探针（Bio-ssDNA）形成夹心模式。然后再通过链霉亲合素与生物素特异性结合引入链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）信号放大剂。最后使用安培法通过监测辣根过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺（TMB）发生氧化还原反应的强弱实现对目标序列的检测。使用循环伏安法（CV）和电化学交流阻抗法（EIS）对TEP传感器的制作过程进行了表征。 3.该TEP传感器对合成目标序列在两个不同浓度范围内的检测响应信号和浓度的对数分别呈两个不同的线性关系，并通过建立类米氏方程模型对该现象进行了分析。该TEP传感器对合成目标序列检测灵敏度约为0.4pM，体现了高灵敏度的特点。能够明显从非完全互补序列中特异性识别区分出目标序列，对碱基突变序列表现出良好的检测特异性。 4.该TEP传感器对咽拭子过滤性甲型H7N9流感病毒RNA提取物的不对称PCR ssDNA目标序列灵敏度的响应信号与ssDNA产物浓度的对数呈良好的线性关系，检测下限为0.1pM，并且该TEP传感器还能够从甲型H1N1和H3N2等其他流感病毒核酸中明显识别区分出甲型H7N9流感病毒，在基因水平上实现了对甲型H7N9流感病毒样本灵敏、特异的检测。 5以甲型H7N9流感病毒cDNA为模板，该TEP传感器能够检测识别出低至一个循环数的不对称PCR ssDNA目标序列。同时，在低循环数下，对甲型H7N9流感病毒cDNA不对称PCR产物具有良好的特异性。
【关键词】：电化学生物传感器 DNA 四面体结构探针 甲型H7N9流感病毒 病原体检测
【学位授予单位】：太原理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q81;R373
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 符号说明与缩略语13-15
• 第一章 绪论15-35
• 1.1 病原微生物的快速检测15-16
• 1.2 生物传感器概述16-19
• 1.2.1 生物传感器的发展历史16-17
• 1.2.2 生物传感器的工作原理17-18
• 1.2.3 电化学生物传感器18-19
• 1.3 DNA 电化学生物传感器19-25
• 1.3.1 工作原理19
• 1.3.2 DNA电化学生物传感器的探针设计19-21
• 1.3.3 DNA探针的修饰固定方法21-22
• 1.3.4 DNA电化学生物传感器信号转换机制22
• 1.3.5 纳米材料用于DNA电化学生物传感器的构建22-25
• 1.4 DNA四面体结构纳米材料25-31
• 1.4.1 自组装原理26-27
• 1.4.2 DNA四面体结构的功能化和智能化27-29
• 1.4.3 在体内诊断与药物治疗方面的应用研究29-30
• 1.4.4 在生物传感器体外检测方面的应用30-31
• 1.5 本研究的目的及意义31-35
• 1.5.1 研究目的及意义31-32
• 1.5.2 本文的主要工作32-35
• 第二章 DNA四面体探针的设计及自组装合成35-43
• 2.1 引言35-36
• 2.2 实验材料和仪器36-37
• 2.2.1 实验试剂及材料36
• 2.2.2 实验仪器36-37
• 2.3 实验方法37-38
• 2.3.1 DNA四面体结构探针的合成37
• 2.3.2 DNA四面体结构探针的PAGE表征37-38
• 2.4 实验结果与讨论38-42
• 2.4.1 DNA四面体结构探针合成效果的定性分析38-40
• 2.4.2 DNA四面体结构探针合成效果的定量分析40-42
• 2.5 本章小结42-43
• 第三章 核酸四面体探针DNA电化学生物传感器的制备及表征43-67
• 3.1 引言43-48
• 3.1.1 循环伏安法43-45
• 3.1.2 交流阻抗法45-47
• 3.1.3 安培法47-48
• 3.2 实验材料和仪器48-49
• 3.2.1 实验试剂48-49
• 3.2.2 实验仪器49
• 3.3 实验方法49-52
• 3.3.1 工作电极的预处理49-50
• 3.3.2 TEP的修饰及生物传感器制作过程的表征50-51
• 3.3.3 与单链DNA探针传感器检测性能的对比51
• 3.3.4 对合成目标序列检测性能的评价51-52
• 3.4 结果与讨论52-64
• 3.4.1 工作电极的预处理效果52-53
• 3.4.2 TEP的修饰及传感器制作过程的CV表征结果53-57
• 3.4.3 TEP的修饰及传感器制作过程的EIS表征结果57-60
• 3.4.4 与单链探针传感器对目标序列检测信号响应的对比60-61
• 3.4.5 对合成目标序列的检测灵敏度61-63
• 3.4.6 对合成目标序列的特异性响应63-64
• 3.5 本章小结64-67
• 第四章 在甲型H7N9 流感病毒核酸检测中的应用67-85
• 4.1 引言67-68
• 4.2 实验材料和仪器68-69
• 4.2.1 实验材料及试剂68-69
• 4.2.2 实验仪器69
• 4.3 实验方法69-75
• 4.3.1 流感病毒的分离培养鉴定69-70
• 4.3.2 RNA的提取与PCR扩增70-73
• 4.3.3 单链DNA目标序列的不对称PCR法制备73-74
• 4.3.4 TEP生物传感器对双链和单链目标物的检测74
• 4.3.5 检测灵敏度的测定74
• 4.3.6 检测特异性的测定74-75
• 4.3.7 对低循环数不对称PCR产物的检测75
• 4.4 结果与讨论75-82
• 4.4.1 流感病毒细胞培养液的血凝滴度75
• 4.4.2 PCR扩增产物的验证结果75-76
• 4.4.3 不对称PCR 目标产物的鉴定76-78
• 4.4.4 TEP生物传感器对双链和单链目标物的检测性能78-79
• 4.4.5 对不对称PCR产物的检测的灵敏度79-80
• 4.4.6 对不对称PCR 产物的特异性响应80-81
• 4.4.7 对低循环数不对称PCR产物的检测响应结果81-82
• 4.5 本章小结82-85
• 第五章 总结与展望85-87
• 5.1 总结85-86
• 5.2 展望86-87
• 参考文献87-99
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文/专利申请目录99-100
• 致谢100-101

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：309414