毕氏酵母中重组人白介素15的表达纯化及其生物学活性鉴定研究

发布时间：2017-04-15 23:07

  本文关键词：毕氏酵母中重组人白介素15的表达纯化及其生物学活性鉴定研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白介素15 (interleukin-15, IL-15)作为一种炎症因子,与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-21一样同属4α超螺旋细胞因子家族。人源IL-15位于4号染色体短臂,含8个外显子和5个内含子,成熟IL-15编码114个氨基酸序列,分子量大小为14-15KDa,主要表达于单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞中。IL-15主要的生物学功能为诱导T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell, NK cell)的分化已及促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。作为一种多效细胞因子,IL-15在免疫,肿瘤发生,过敏性反应及自身免疫疾病中均发挥着重要作用。在本研究中,我们构建了一种C端带His标签和Myc标签的重组人白介素15 (rhIL-15)的表达载体pPICZaA-Pro-hIL-15-Tag。重组表达载体经转化毕氏酵母表达菌株X-33后,阳性表达菌株rhIL-15表达产量高达75mg/L。X-33菌株表达的rhIL-15经镍离子亲和层析柱、DEAE阴离子交换柱纯化后纯度可达95%。毕氏酵母表达的重组白介素15存在不同程度的N-糖基化修饰形式,其分子量比预测理论分子量偏大。毕氏酵母中表达纯化的rhIL-15可促进小鼠CTLL-2及人NK细胞的增殖,具有良好的生物学活性。
【关键词】：白介素15 毕氏酵母 蛋白表达纯化 N-糖基化
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416;Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 研究背景8-27
• 1.1 重组蛋白表达系统8-19
• 1.1.1 大肠杆菌表达系统8-10
• 1.1.2 酵母表达系统10-15
• 1.1.3 丝状真菌表达系统15
• 1.1.4 杆状病毒表达系统15-16
• 1.1.5 哺乳动物细胞表达系统16-18
• 1.1.6 植物表达系统18-19
• 1.2 白介素1519-27
• 1.2.1 白介素15结构19-20
• 1.2.2 白介素15信号通路20-22
• 1.2.3 白介素15与肿瘤22-24
• 1.2.4 白介素15的临床前研究24-25
• 1.2.5 白介素15毒性25-27
• 第二章 材料与方法27-44
• 2.1 实验材料27-33
• 2.1.1 仪器27-29
• 2.1.2 常规试剂及试剂盒29-30
• 2.1.3 耗材30-31
• 2.1.4 菌株及质粒31
• 2.1.5 溶液配制31-33
• 2.2 实验方法33-44
• 2.2.1 毕氏酵母分泌型pPICZαA-Pro-rhIL-15-Tag表达载体构建33-37
• 2.2.2 载体pPICZaA-Pro-rhIL-15-Tag转化毕氏酵母X-33菌株37-38
• 2.2.3 白介素15多拷贝子高水平分泌表达酵母转化子的筛选38
• 2.2.4 rhIL-15/X-33多拷贝酵母转化子的小量诱导表达38-40
• 2.2.5 rhIL-15在摇瓶条件下的扩大表达40-41
• 2.2.6 毕氏酵母表达上清中rhIL-15的纯化41
• 2.2.7 肽指纹图谱分析及比对41-42
• 2.2.8 rhIL-15的去糖基化42
• 2.2.9 rhIL-15的生物学活性测定42-44
• 第三章 结果与分析44-55
• 3.1 重组白介素15表达载体pPICZαA-Pro-rhIL-15-Tag构建44-46
• 3.2 重组白介素15高拷贝表达菌株筛选46
• 3.3 rhIL-15/X-33表达菌株小量诱导表达46-47
• 3.4 rhIL-15/X-33表达菌株大量诱导表达纯化47-49
• 3.5 rhIL-15肽脂纹图谱分析49-50
• 3.6 rhIL-15的去糖基化50-52
• 3.7 rhIL-15的生物学活性测定52-55
• 第四章 讨论55-57
• 第五章 本文小结57-58
• 附录58-61
• 参考文献61-66
• 致谢66-67
• 在读期间(待)发表的学术论文与取得的其他研究成果67

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3 许y斏，

本文编号：309463