金黄色葡萄球菌毒力调控蛋白SarV、SarX和RNA酶J1、J2的结构生物学研究

发布时间：2017-04-15 23:17

本文关键词：金黄色葡萄球菌毒力调控蛋白SarV、SarX和RNA酶J1、J2的结构生物学研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细菌感染是导致人类各种疾病的重要原因。但随着抗生素的广泛应用,细菌的抗药性也越来越严重。金黄色葡萄球菌是一种在医院和社区中广泛存在的条件致病菌,其感染能导致食物中毒、肺炎、脑膜炎、心内膜炎和中毒性休克综合症等严重疾病。由于它对包括万古霉素在内的几乎所有抗生素的耐药性,金黄色葡萄球菌感染的发病率和死亡率一直高居不下,已经成为危害人类健康的一个非常严重的问题。金黄色葡萄球菌感染一般从伤口扩散到血液,进一步侵染到宿主的不同组织。进入组织后,金黄色葡萄球菌会产生大量毒力因子,包括细菌表面相关蛋白、酶、外毒素、荚膜多糖及能进行组织定位、组织破坏和免疫逃避的基因产物。这类毒力基因的表达受调控基因的调控,比如双组份调控系统(agr、saeRS、srrAB、 arlRS)和全局转录调控系统(sarA、sigB、sarA同系物、tcaRA等)。SarV和SarX就是全局转录调控系统中的一员,对于细菌的侵染和毒力调控非常重要。我们希望通过解析SarV和SarX的晶体结构及其与DNA复合物的结构,了解其与DNA结合机制从而进一步了解它们对毒力因子表达的调控机制,为抗菌药物的研发提供线索。 RNA的降解过程需要受到严格的调控,从而保证降解过程是有序和协调的。虽然RNA降解体在组成上不保守,在进化上也没有共同的祖先,但在不同的细菌中都能发现降解体的存在,这暗示了RNA降解体在细菌的RNA代谢过程中扮演着重要角色。金黄色葡萄球菌中RNA降解体包含enolase、pfkA、PNPase、 RNase J1、RNase J2、RNase Y、CshA等多种组分,其中RNA降解主要由RNaseJ1和RNase J2来完成。虽然人们对RNA的降解已经进行了较多的研究,但是RNA降解体的装配过程以及各成员之间的相互作用机制却并不清楚。我们希望通过对RNase J1和J2的结构和功能的研究,揭示其在金黄色葡萄球菌RNA降解体中的作用机理。我们对SarX和SarV进行了表达纯化与晶体筛选,收集了野生型SarV蛋白晶体的X-射线衍射数据；也得到了可用于结构解析的硒代SarX蛋白晶体的X-射线衍射数据,确定了SarX晶体结构的相位并初步解析了其结构；表达纯化了RNase J1和J2并进行了晶体筛选,在多个条件下得到了晶体并得到了一套衍射分辨率为3.7A的X-射线衍射数据,验证了RNase J1与J2的相互作用,检测了RNase J1与RNA降解体亚基PNPase和CshA的相互作用。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 自溶 毒力因子 RNA降解体 晶体 X-射线衍射
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.11
【目录】：

摘要5-6
ABSTRACT6-11
第一篇金黄色葡萄球菌毒力调控因子SarX和SarV的研究进展11-25
第一章综述11-21
1.1.1 金黄色葡萄球菌简介11
1.1.2 致病机制11-12
1.1.3 SarA蛋白家族分类12
1.1.4 agr基因的激活与调控12
1.1.5 agr基因相关的其他调控因子12-13
1.1.6 SarA蛋白家族成员与功能13-15
1.1.7 SarA蛋白家族各成员介绍15-18
1.1.7.1 SarA蛋白的结构与功能15-17
1.1.7.2 SarA蛋白家族与DNA结合模式17
1.1.7.3 SarA蛋白家族其他成员简介17-18
1.1.8 SarV蛋白的发现与功能研究18
1.1.9 SarX蛋白的发现及其生物功能18-20
1.1.10 本章小结20-21
参考文献21-25
第二篇 SarV蛋白的结构生物学研究25-47
第一章材料与方法25-36
2.1.1 仪器设备25
2.1.2 实验试剂25-26
2.1.3 实验菌株和培养基26-27
2.1.4 SarV表达质粒的构建27-30
2.1.5 SarV蛋白可溶表达筛选30-31
2.1.6 野生型SarV蛋白的大量表达31
2.1.7 野生型SarV蛋白的纯化31-32
2.1.8 硒代SarV蛋白的表达纯化32
2.1.9 野生型和硒代SarV蛋白结晶条件的筛选和优化32-33
2.1.10 野生型SarV蛋白晶体X-射线衍射数据的收集和处理33-34
2.1.11 SarV蛋白晶体浸泡重原子的X-射线衍射数据收集和处理34
2.1.12 晶体结构解析34-36
第二章实验结果和讨论36-47
2.2.1 SarV蛋白全长表达质粒构建36
2.2.2 野生型SarV蛋白的表达、纯化和晶体筛选36-38
2.2.3 SarV蛋白的二级结构预测38-39
2.2.4 SarV截短体蛋白的表达、纯化和晶体筛选39-40
2.2.5 SarV全长蛋白的晶体筛选和优化40-41
2.2.6 SarV全长蛋白晶体X-射线衍射数据的收集和处理41-42
2.2.7 SarV蛋白晶体泡重原子的X-射线衍射数据的收集和处理42-43
2.2.8 硒代SarV蛋白的表达、纯化和晶体筛选43-45
2.2.9 本章小结45-47
第三篇 SarX蛋白的结构生物学研究47-63
第一章材料与方法47-51
3.1.1 仪器设备47
3.1.2 实验试剂47
3.1.3 实验菌株和培养基47
3.1.4 SarX表达质粒的构建47-48
3.1.5 SarX蛋白可溶表达筛选48
3.1.6 野生型SarX蛋白的表达48-49
3.1.7 野生型sarX蛋白的纯化49
3.1.8 硒代sarX蛋白的表达纯化49
3.1.9 野生型和硒代SarX蛋白结晶条件的筛选和优化49
3.1.10 野生型和硒代SarX蛋白晶体X-射线衍射数据的收集和处理49-50
3.1.11 晶体结构解析50-51
第二章实验结果和讨论51-62
3.2.1 SarX蛋白表达质粒构建51
3.2.2 SarX全长蛋白的表达和纯化51-52
3.2.3 SarX全长蛋白的晶体生长52-53
3.2.4 SarX野生型蛋白的二级结构预测53-54
3.2.5 SarX截短体蛋白的表达、纯化和晶体筛选54-56
3.2.6 晶体X-射线衍射数据的收集与处理56-57
3.2.7 晶体结构解析与初步分析57-60
3.2.8 本章小结60-62
参考文献62-63
第四篇金黄色葡萄球菌RNase J1和J2的结构生物学研究63-91
第一章绪论63-72
4.1.1 RNA降解体概述63-65
4.1.2 调控RNA稳定性的核酸酶分类65-67
4.1.3 大肠杆菌核酸内切酶RNaseE结构与功能分析67-68
4.1.4 枯草芽孢杆菌RNA降解体组成68-69
4.1.5 RNA降解体成员RNase J1和J269-70
4.1.6 金黄色葡萄球菌RNA降解体简介70-71
4.1.7 本章小结71-72
第二章实验材料和方法72-77
4.2.1 RNase J1和J2质粒的构建72-73
4.2.2 蛋白的表达和纯化73-74
4.2.3. RNase J1和J2共表达、共纯化和共结晶74
4.2.4 RNase J1和J2蛋白的结晶条件筛选74
4.2.5 晶体的优化74-75
4.2.6 RNase J1和J2的GST-pulldown实验75-76
4.2.7 RNase J1和PNPase,CshA蛋白的GST-pulldown实验76-77
第三章实验结果和讨论77-87
4.3.1 RNase J1和J2的质粒构建与小量表达77
4.3.2 RNase J1的纯化77-78
4.3.3 RNase J2的纯化78-79
4.3.4 RNase J1和J2相互作用验证79-80
4.3.5 RNase J1和J2的共纯化和共表达80-82
4.3.6 RNase J1和J2的晶体筛选82-83
4.3.7 RNase J1和J2晶体优化、数据收集和处理83-85
4.3.8 RNase J1与PNPase,CshA蛋白相互作用的检测85
4.3.9 RNase J1和J2在溶液中的聚集状态85
4.3.10 本章小结85-87
参考文献87-91
致谢91-93
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果93

【共引文献】

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