构建人呼吸道合胞病毒反基因组cDNA及其拯救尝试

发布时间：2017-04-16 02:01

  本文关键词：构建人呼吸道合胞病毒反基因组cDNA及其拯救尝试，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：通过RNA反向遗传学操作,克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)反基因组cDNA,并构建以T7RNA多聚酶(T7RNA polymerase, T7RNP)为启动子、插入有绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein, EGFP)的RSV反基因组cDNA重组质粒pBRAT-RSV-EGFP,通过MVA-T7痘苗病毒等提供T7RNP,探讨拯救可表达EGFP的重组人呼吸道合胞病毒(rRSV/EGFP)的条件。 方法：利用分子病毒学和分子生物学技术,以经过改造的pBR322质粒为克隆载体,通过多步克隆操作,获得编码RSV反基因组的cDNA克隆,并且将EGFP表达盒插入到RSV反基因组cDNA扣,构建重组RSV反基因组质粒pBRAT-RSV-EGFP。克隆的反基因组cDNA位于T7启动子下游和丁肝核酶(HDV ribozyme,δ)以及T7转录终止信号的上游,经核酸内切酶及核酸序列分析后,分别用MVA-T7病毒、BSR T7/5细胞和pcDNA3.1-T7RNP质粒提供T7RNP,同时转染pBRAT-RSV-EGFP,经转录获得重组RSV单股正链的反基因组,以可表达四种RSV核衣壳蛋白或多聚酶蛋白的质粒pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT、pcDNA3.1-M2-1-OPT和pcDNA3.1-L-OPT为辅助质粒,并共转染至BSR T7/5细胞或瞬时表达T7RNP的HEp-2拯救rRSV/EGFP,观察绿色荧光表达情况评估拯救的条件。 结果：经核酸内切酶及核酸序列分析证实,RSV反基因组cDNA及插入有EGFP的RSV反基因组cDNA克隆及其重组质粒均成功获得。与BSR T7/5细胞和pcDNA3.1-T7RNP质粒相比,以MVA-T7感染HEp-2细胞,能够高效提供T7RNP,是用于重组RSV拯救的有效方法。 结论：成功克隆及构建了可表达EGFP的RSV反基因组cDNA及其重组质粒,并对拯救体系进行了比较研究,这些工作为最终实现重组RSV的成功拯救提供了有益的经验。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 绿色荧光蛋白 反向遗传学 拯救 反基因组 cDNA克隆
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R373.1
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 1 引言10-12
• 2 实验材料12-16
• 2.1 细胞、载体、感受态细胞和病毒12
• 2.2 工具酶与试剂盒12
• 2.3 主要生化试剂12-13
• 2.4 主要实验仪器13-14
• 2.5 主要溶液配制14-16
• 3 实验方法16-42
• 3.1 细胞培养16-17
• 3.2 感受态细胞的制备17-18
• 3.3 EGFP基因的获得与鉴定18-22
• 3.3.1 EGFP基因的PCR扩增18-19
• 3.3.2 PCR产物的胶回收19-20
• 3.3.3 PCR产物加A尾及纯化20
• 3.3.4 T载体连接及转化20-21
• 3.3.5 质粒的提取及鉴定21-22
• 3.4 RSV反基因组cDNA的分段克隆22-29
• 3.5 SH基因的改造29-31
• 3.6 PBRAT质粒的构建及鉴定31-33
• 3.6.1 DNA连接子的获得31
• 3.6.2 酶切pBR322载体并回收31-32
• 3.6.3 pBRAT质粒的连接及鉴定32-33
• 3.7 携带EGFP基因的RSV反基因组质粒的构建及鉴定33-39
• 3.7.1 携带EGFP基因的RSV反基因组质粒的构建33-37
• 3.7.2 携带EGFP基因的RSV反基因组质粒的鉴定37-39
• 3.8 MVA-T7病毒培养与鉴定39
• 3.8.1 MVA-T7病毒的培养39
• 3.8.2 免疫酶法测定MVA-T7病毒的滴度39
• 3.9 重组RSV病毒的拯救39-42
• 3.9.1 MVA-T7拯救重组RSV病毒40
• 3.9.2 用质粒提供T7 RNP拯救重组RSV病毒40-41
• 3.9.3 用BSR T7/5细胞拯救重组RSV病毒41-42
• 4 实验结果42-51
• 4.1 质粒和病毒的鉴定42-46
• 4.1.1 RSV反基因组cDNA各片段克隆质粒及pBRAT载体的鉴定42-44
• 4.1.2 SH基因改造的鉴定44
• 4.1.3 携带EGFP基因的重组RSV反基因组质粒的鉴定44-45
• 4.1.4 MVA-T7病毒的鉴定45-46
• 4.2 MVA-T7拯救重组RSV病毒46-47
• 4.3 用质粒提供T7 RNP拯救重组RSV病毒47
• 4.4 用BSR T7/5细胞拯救重组RSV病毒47-48
• 4.5 重组RSV基因组核酸序列分析48-51
• 5 讨论51-53
• 6 结论53-54
• 参考文献54-56
• 附录A 英文缩略词表56-57
• 硕士期间发表论文情况57-58
• 作者简历58-60
• 学位论文数据集60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 何金生;付远辉;洪涛;;人呼吸道合胞病毒活疫苗研究进展[J];中国科学:生命科学;2011年01期

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本文编号：309739