HIPK2调控神经干细胞增殖与凋亡的作用研究

发布时间：2017-04-16 02:23

  本文关键词：HIPK2调控神经干细胞增殖与凋亡的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：前言:哺乳动物中枢神经系统的发育是一个多步骤、复杂的渐进过程,其中神经干细胞作为整个神经系统发育中各种类型神经细胞的唯一来源,在大脑结构形成和神经功能完整性的建立中占据重要的地位。既往研究发现在神经干细胞增殖、自我更新及分化过程中,Notch信号通路发挥重要作用,然而其具体机制尚未完全阐明。近年来有研究发现同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)可能与Notch信号通路相互作用参与调节神经干细胞分化过程。本课题组前期对小鼠脑组织中Notch信号下游关键转录因子RBP-J进行特异性敲除,通过基因芯片检测分析发现:在特异性阻断Notch信号通路后,Hipk2表达下调。由此我们推测Hipk2可能在Notch信号的调节下发挥调控神经干细胞增殖、分化及凋亡的作用。本研究拟运用多种实验体系和研究方法,探索Hipk2对神经干细胞增殖及凋亡的影响及Notch信号对Hipk2的调控作用,为进一步揭示神经干细胞增殖、自我更新及分化机制开辟新的视角。实验方法:(1)利用实时定量PCR方法,检测神经干/祖细胞系(C17.2细胞)、原代神经干细胞及原代神经干细胞诱导分化7天后细胞内Hipk2的表达。运用原位杂交实验,观察胚胎12.5及14.5天胎鼠大脑组织和视网组织中Hipk2的表达。(2)运用分子克隆技术,构建PCAG-Hipk2-IRES-EGFP质粒,并通过菌液PCR反应和双酶切反应对构建质粒进行鉴定后公司测序。在此基础上运用细胞脂质体转染技术,将Hipk2表达质粒(PCAG-Hipk2-IRES-EGFP)和载体质粒(PCAG-IRESEGFP)分别转染入C17.2细胞过表达48小时后,采用MTT比色法、流式细胞周期检测技术、细胞Ki67免疫荧光染色及细胞Edu掺入实验,检测Hipk2对C17.2细胞增殖的影响,并通过细胞流式凋亡检测技术和Western blot技术,检测Hipk2对C17.2细胞凋亡的影响。(3)利用实时定量PCR方法和Western blot技术,分别检测25μM和75μM Notch抑制剂GSI干预C17.2细胞24小时和48小时后细胞内Hipk2的表达。利用TRANSFAC,NCBI,promoter scan等软件分析Hipk2启动子中可能存在的Notch信号作用位点(如RBP-J、Hes等)。为明确Notch信号通路对Hipk2的调节作用,运用分子克隆技术,构建PGL3-Basic-Hipk2-promoter质粒,并通过菌液PCR反应和双酶切反应对构建质粒进行鉴定后公司测序。在此基础上利用细胞脂质体转染技术,将PGL3-Basic-Hipk2-promoter质粒和内参质粒p RL-TK分别转染至神经干/前体细胞系(C17.2细胞),小鼠海马神经元细胞系(HT-22细胞),人肾上皮细胞系(293T细胞),小鼠胚胎成纤维细胞系(3T3细胞),通过双荧光素酶报告基因实验检测不同细胞中Hipk2的萤光素酶活性。进一步利用细胞脂质体转染技术,将PCAG-NICDGFP质粒、PGL3-Basic-Hipk2-promoter质粒、内参质粒p RL-TK、工具质粒PCAG-GFP共转染至293T细胞和C17.2细胞,检测两种细胞中Notch受体胞内段(NICD)作用后Hipk2的荧光素酶活性,并运用同样的实验方案和方法分别检测Notch通路关键转录因子RBP-J、Notch下游基因Hes1作用后Hipk2的荧光素酶活性。实验结果:(1)实时定量PCR检测发现,神经干/祖细胞系(C17.2细胞)、原代神经干细胞及原代神经干细胞诱导分化7天后细胞内均存在Hipk2的表达。进一步分析发现与原代神经干细胞相比,Hipk2在原代神经干细胞诱导分化7天后表达降低。胎鼠大脑及视网膜原位杂交结果显示,Hipk2广泛表达于胎鼠大脑和视网膜组织,且在大脑脑室下带以及视网膜成神经细胞层和神经节细胞层中表达较强。(2)运用分子克隆技术成功构建Hipk2表达序列质粒(PCAG-Hipk2-IRESEGFP)后,MTT、流式细胞周期检测以及细胞Ki67免疫荧光染色及细胞Edu掺入实验检测结果均显示,与载体质粒转染组相比,Hipk2过表达后能够抑制C17.2细胞增殖。流式凋亡检测和活化caspase-3及Bcl-2蛋白表达水平检测结果显示Hipk2能够促进C17.2细胞凋亡。(3)实时定量PCR和Western blot实验结果显示,与对照组(DMSO干预)相比,GSI干预组细胞中Hipk2在转录水平和蛋白水平的表达均降低。生物信息学预测软件TRANSFAC,NCBI及promoter scan等综合分析Hipk2启动子序列后,结果显示Hipk2启动子区存在2个RBP-J结合位点(GTGGGAA、TTCCCAC),9个Hes1结合位点即N-box位点(CACNAG)。运用分子克隆技术成功构建PGL3-Basic-Hipk2-promoter质粒后,双荧光素酶报告基因实验检测结果显示在HT-22细胞、3T3细胞、293T细胞及C17.2细胞中Hipk2的表达存在差异,为此我们选取Hipk2表达较高的293T细胞和表达较高且具有神经特异性的C17.2细胞作为我们下述研究的细胞基础。运用双荧光素酶报告基因实验分别检测NICD、RBP-J、Hes1对Hipk2启动子调节作用的结果显示,NICD和RBP-J均能作用于Hipk2,激活其启动子的表达。在293T细胞中Hes1能较强的抑制Hipk2启动子的表达,使其表达降低,然而在C17.2细胞中这种抑制作用并不明显。结论:(1)Hipk2在神经干/祖细胞系和原代神经干细胞及胎鼠大脑、视网膜中均高表达。(2)体外过表达Hipk2能抑制神经干/前体细胞增殖并促进凋亡。(3)初步证实Notch信号通路中关键分子NICD、RBP-J对Hipk2启动子表达具有显著的调控作用。
【关键词】：同源结构域相互作用蛋白激酶2 神经干细胞 Notch信号通路 增殖 凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-25
• 实验一Hipk2 在神经干细胞及胚胎大脑视网膜组织中的表达25-35
• 1 材料25-26
• 2 方法26-31
• 3 结果31-33
• 4 讨论33-35
• 实验二HIPK2 对神经干细胞增殖和凋亡的调节作用35-48
• 1 材料35-36
• 2 方法36-40
• 3 结果40-46
• 4 讨论46-48
• 实验三Notch信号通路对Hipk2 表达调控作用48-63
• 1 材料48-49
• 2 方法49-57
• 3 结果57-61
• 4 讨论61-63
• 小结63-64
• 参考文献64-71
• 个人简历和研究成果71-72
• 致谢72

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘福学;夏青生;邱杰;刘晓露;李圆;;C-myb和p53在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义[J];肿瘤学杂志;2015年04期

  本文关键词：HIPK2调控神经干细胞增殖与凋亡的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：309808