miR-21体外转染神经元方案优化及其在体外TBI模型中神经保护作用的机制研究

发布时间：2017-04-16 08:22

  本文关键词：miR-21体外转染神经元方案优化及其在体外TBI模型中神经保护作用的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究首先通过在不同转染条件下,包括不同的转染溶剂、预处理和转染试剂浓度,对miR-21在神经元内表达水平和神经元损伤的检测,建立一种稳定、高效,并且对神经元损伤较小的转染方案。进一步通过转染体外神经元,并通过TBI模型来检测miR-21在TBI过程中是否发挥抗凋亡作用并探索其可能的作用机制,为进一步的研究和颅脑创伤的临床基因治疗提供理论依据方法:神经元取自24小时的Wistar乳鼠,培养7天。标记FAM的miR-21Agomior用于检测miR-21是否可以转染进入神经元。神经元随机分为5组:饥饿-DMEM(S-DMEM)组、非饥饿-DMEM(N-DMEM)组、饥饿-Neurobasal(S-Neurobasal)组和非饥饿-Neurobasal(N-Neurobasal)组和空白对照组(Sham)。miR-21 oligomers(20μM,2.5μl)与RNAiMAX(0.5/1/1.5/2/2.5μl)融合后,加入DMEM或Neurobasal-A使转染液达到500μl或250μl。饥饿组在转染前,仅加入250μlDMEM或Neurobasal行饥饿1小时。然后将转染液加入各组的到6孔板中转染6小时,继续培养48小时进行下一步的试验分析。mi R-21在神经元内的表达通过RT-PCR及miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表达情况来检测。同时为了避免miR-21的生物学作用对神经元损伤的影响,将miR-21 agomir更换为miR-21 negative control后,进行转染后,通过TUNEL凋亡试剂盒和MTT试验检测神经元损伤情况。按照上述转染方案,将FAM标记的miR-21 agomir用于检测miR-21的转染效率。然后将细胞随机分为5组:空白组,TBI组,TBI+miR-21agomir(TBI-A)组,TBI+miR-21 antagomir(TBI-AN)组和TBI+miR-21 negative control(TBI-NC)组。mi R-21 agomir,miR-21 antagomir和mi R-21 negative control按相应组进行转染;转染后48小时,除空白组外,分别进行划痕损伤。划痕损伤后24小时,各组神经元内miR-21和PTEN表示水平通过RT-PCT检测;各组神经元的凋亡情况通过TUNEL和MAP-2荧光双染检测。Western Blot检测PTEN、总AKT、p-AKT,以及其下游凋亡相关蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况。结果:FAM-miR-21可以转染进入神经元。miR-21在Neurobasal组中比DMEM组中表达明显升高,同时RANiMAX在1.5μl时,miR-21的表达水平达到最高峰,继续增加RANiMAX剂量没有增高miR-21的表达水平。同时神经元损伤具有条件依赖性和剂量依赖性,饥饿组凋亡细胞相对于非饥饿组明显增加,同时相对于RNAiMAX:miR-21=4/5:5,RNAiMAX:mi R-21=1/2/3:5的凋亡神经元明显减少。随后的试验证明,划痕损伤的神经元引起TBI中相似的凋亡情况,并且miR-21 agomir/antagomir可以上调/下调神经元中miR-21的表示水平。同时,TUNEL结果显示:miR-21减少TBI损伤中TUNEL阳性细胞。对PTEN-AKT通路检测发现:miR-21降低PTEN的基因表达水平和蛋白表达水平,并且使p-KAT表达水平升高。Western Blot检测凋亡相关蛋白结果显示:mi R-21减少caspase-9、cleavaged caspase-3和Bcl-2表达,而增加Bax在神经元中的表达。结论:miR-21转染神经元的方案是以Neurobasal-A为溶剂,不经过饥饿处理,在miR-21 agomir:RNAiMAX=3:5的比例下进行转染;同时通过上调或者下调神经元中miR-21表示水平发现,miR-21可以减少体外TBI模型中神经元的凋亡,同时研究发现,miR-21是通过作用于PTEN-AKT通路,调节下游相关凋亡蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表达水平来发挥作用的。
【关键词】：颅脑损伤 mi R-21 神经元 转染 lipofectamine RNAiMAX 凋亡 PTEN-AKT 通路
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.15;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、神经元提取和miR-21转染神经元方案优化15-35
• 1.1 对象和方法15-28
• 1.1.1 实验动物15
• 1.1.2 实验仪器15-16
• 1.1.3 试剂和耗材16-17
• 1.1.4 主要试剂、液体的配制17-18
• 1.1.5 实验方法18-28
• 1.2 结果28-33
• 1.2.1 神经元的分离培养28-29
• 1.2.2 FAM-miR-21转染神经元和MAP-2 染色29-30
• 1.2.3 转染后神经元内miR-21的表达30-31
• 1.2.4 转染后神经元内miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表达31
• 1.2.5 转染后神经元的凋亡31-33
• 1.2.6 神经元转染后的细胞活性33
• 1.3 讨论33-34
• 1.4 小结34-35
• 二、miR-21抑制体外TBI模型中神经元凋亡的现象观察35-44
• 2.1 对象和方法35-40
• 2.1.1 实验动物35
• 2.1.2 实验仪器35-36
• 2.1.3 试剂和耗材36
• 2.1.4 主要试剂、液体的配制36
• 2.1.5 实验方法36-40
• 2.2 结果40-43
• 2.2.1 mi R-21在神经元内的转染效率和表达水平变化40-41
• 2.2.2 miR-21抑制TBI损伤后神经元的凋亡41-43
• 2.3 讨论43
• 2.4 小结43-44
• 三、miR-21通过PTEN-AKT通路抑制体外TBI模型中神经元的凋亡44-54
• 3.1 对象和方法44-48
• 3.1.1 实验动物44
• 3.1.2 实验仪器44
• 3.1.3 试剂和耗材44-45
• 3.1.4 主要试剂、液体的配制45
• 3.1.5 实验方法45-48
• 3.2 结果48-52
• 3.2.1 miR-21抑制PTEN蛋白质水平的表达48-49
• 3.2.2 miR-21通过抑制PTEN表达来减少p-Akt的表达49-50
• 3.2.3 miR-21通过作用于PTEN-Akt通路来调节下游的凋亡相关蛋白50-52
• 3.3 讨论52-53
• 3.4 小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-59
• 发表论文和参加科研情况说明59-60
• 附录60-61
• 综述 miR-21在中枢神经系统疾病中作用的研究进展61-70
• 综述参考文献67-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孙婷怡;陈晓瑞;刘子龙;赵丽丽;江永祥;屈国强;王荣帅;黄锶哲;刘良;;Expression Profiling of MicroRNAs in Hippocampus of Rats Following Traumatic Brain Injury[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年04期

  本文关键词：miR-21体外转染神经元方案优化及其在体外TBI模型中神经保护作用的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：310417