基于流感HA2的重组NoV P-particle免疫原性和保护性研究

发布时间：2017-04-16 22:05

  本文关键词：基于流感HA2的重组NoV P-particle免疫原性和保护性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流感病毒严重影响人类健康和经济发展,每年都会出现大量的患病和死亡病例。尽管过去的十年里,抗病毒治疗已经取得较好的发展,免疫仍然是预防和控制流感的最有效的措施。由于病毒HA1蛋白的高突变性,使得针对病毒“头部”区的广谱疫苗设计变得很困难。研究表明,流感病毒HA2蛋白相对保守,其结构变化在病毒感染宿主细胞的过程中起着至关重要的作用,成为许多流感病毒广谱中和抗体的作用靶点,因此是流感通用型疫苗的研究热点。流感病毒HA前体蛋白HA0在宿主蛋白酶的作用下裂解产生HA1和HA2蛋白,对于膜融合是必不可少的过程。HA1与宿主细胞受体结合,经过内吞过程,在内涵体低p H(5-6)条件下,HA2会发生一系列的构象变化,在融合前状态下隐藏的流感表位会发生短暂的暴露,被免疫系统所识别,产生免疫应答。但是由于隐藏的表位暴露时间短,免疫应答较弱。针对HA2的保守区设计能够产生较强的免疫应答的流感表位是本论文研究的重点。研究表明No V P蛋白有三个突出的loops,可以插入外源表位,呈递抗原。E.coli表达的No V P重组蛋白能够自发形成直径约20nm的二十四聚体P-particle,增强免疫原性。我们分析了17524株H1,10763株H3,4022株B型流感HA2保守性,结合表位预测网站进行预测,筛选出三条可能产生较强免疫应答的HA2型表位H1:DIWTYNAELLVLLENE,H3:DLWSYNAELLVALENQ,B:TISSQIELAVLLSNE C。将三条设计表位单独和共同插入No V P蛋白的三个loops上,表位和loop之间用GGGGS作为linker,便于将表位突出暴露在病毒P-particle外,通过原核表达得到四种嵌合流感表位的No V P-particle:PP-H1,PP-H3,PP-B,PP-H1-H3-B,经过粒径分析,电镜观察进行结构表征,然后免疫,期望获得针对流感病毒HA2的广谱中和抗体。BALB/c雌鼠免疫四次,间隔两周,评价重组蛋白免疫原性。结果表明免疫血清针对H1,H3,B型流感HA2表位特异性抗体效价分别为1.25*105,1.17*105和7.03*104。PP-H1-H3-B免疫血清针对H1,H3,B表位抗体效价分别为:1.15*105,9.91*104和2.25*104。交叉结合活性研究发现,免疫血清均能与另外两种表位结合。PP-H1免疫血清针对H3和B表位的抗体效价为:1.11*105和3.14*103,PP-H3免疫血清针对H1和B表位的抗体效价为:1.16*105和3.26*103,PP-B免疫血清针对H1和H3表位的抗体效价为:1.59*104和1.32*104,这种交叉结合间接证明了我们设计的流感表位的通用性。由于筛选的表位位于病毒HA2,免疫血清不会有血凝抑制现象,与血凝抑制实验结果一致。抗体分型发现,免疫血清中Ig M和Ig G1有显著提升,重组蛋白诱导的免疫反应主要是体液免疫,伴有较弱的细胞免疫。体外微中和实验结果表明重组蛋白免疫血清对两株H3亚型病毒均有明显的中和活性,PP-H1组对两株H3亚型病毒ID50分别是614.0,1113。PP-H3组对两株H3亚型病毒ID50分别是908.2,1592.8。PP-B组对两株H3亚型病毒ID50分别是410.9,653.2。PP-H1-H3-B组对H3亚型病毒ID50分别是1438.2,523.2。小鼠免疫PP-H1-H3-B后,采用H3亚型病毒进行攻毒。3天后取肺组织检测肺部病毒拷贝数为103.157-3.17,与PBS对照组(103.77-3.79)比较存在显著性差异。结果表明PP-H1-H3-B免疫后能够有效抑制病毒在小鼠肺部复制,降低肺部病毒载量。综上,PP-epitopes主要是针对流感病毒HA2蛋白在病毒感染宿主细胞过程中构象变化特点以及HA2蛋白保守性而设计的,免疫血清与表位有交叉结合性,四种重组蛋白免疫血清对两株H3亚型病毒具有中和活性,为通用型流感疫苗的研发提供了一定的基础。但是病毒免疫原的设计要综合考虑体液免疫和细胞免疫,平衡两者的比重。PP-epitopes在流感病毒疫苗应用中不仅能够降低研发成本,而且能够缩短研发周期,有效的应对流感大爆发。
【关键词】：流感病毒HA2 表位 广谱中和抗体 P-particle 抗体效价
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.13
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略词表9-13
• 第一部分 绪论13-25
• 1.1 流感病毒简介13-16
• 1.1.1 流行性感冒13-14
• 1.1.2 流感病毒结构特点14
• 1.1.3 流感病毒的分型14-15
• 1.1.4 流感病毒HA蛋白15-16
• 1.2 流感病毒的感染机制16-17
• 1.3 流感病毒的预防与治疗手段17-21
• 1.3.1 抗病毒药物18-19
• 1.3.2 灭活病毒疫苗19
• 1.3.3 减毒活疫苗19-20
• 1.3.4 DNA疫苗20
• 1.3.5 基于HA2的新型通用保护性疫苗20-21
• 1.4 诺如病毒(NoV) P-particle21-23
• 1.4.1 NoV结构特点21-22
• 1.4.2 NoV P-particle呈递抗原22-23
• 1.5 本课题的立题依据及实验设计23-25
• 1.5.1 立题依据23-24
• 1.5.2 实验设计24-25
• 第二部分 实验材料与方法25-46
• 2.1 实验材料25-36
• 2.1.1 基因合成25-29
• 2.1.2 主要试剂29-31
• 2.1.3 主要仪器31-32
• 2.1.4 质粒，菌种和细胞32
• 2.1.5 试剂配制32-35
• 2.1.6 细胞系，病毒，实验动物35-36
• 2.2 实验方法36-46
• 2.2.1 流感表位的筛选36
• 2.2.2 pET-28a-PP-epitope嵌合质粒的构建36-38
• 2.2.3 重组蛋白表达，，包涵体检测38-39
• 2.2.4 蛋白纯化及蛋白透析复性39-40
• 2.2.5 蛋白性质分析40-41
• 2.2.6 动物免疫41
• 2.2.7 免疫效果评价41-46
• 第三部分 实验结果与分析46-63
• 3.1 流感表位的筛选46-51
• 3.2 pET-28a-PP-epitope嵌合质粒的构建51
• 3.3 重组蛋白表达，包涵体检测及纯化51-54
• 3.4 重组蛋白结构表征54-55
• 3.5 免疫效果评价55-62
• 3.5.1 抗血清和表位结合性测定55-58
• 3.5.2 血凝和血凝抑制实验58-59
• 3.5.3 抗体分型检测59-60
• 3.5.4 抗体中和能力测定60-62
• 3.6 攻毒效果评价62-63
• 讨论63-65
• 结论65-66
• 参考文献66-74
• 作者简介74-75
• 致谢75

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本文编号：311760