Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠低血钾疾病模型的评估及其机制的探讨

发布时间：2017-04-18 08:19

  本文关键词：Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠低血钾疾病模型的评估及其机制的探讨，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的Cchl1a3基因(相当于人类CACNA1S基因)第528位精氨酸被组氨酸所替代(R528H)是与低钾型周期性麻痹(Hypokalemic periodic paralysis,Hypo PP)有关的错义突变,Hypo PP是以肌无力或肌麻痹为表现的离子通道异常性疾病,以周期性发作为特征,目前其发病机制尚不十分明确。近年来有研究发现部分Hypo PP患者本身就携带突变基因,其主要涉及的与离子通道相关的突变基因除了CACNA1S基因外,还有SCN4A基因和KCNE3基因,其中以CACNA1S-R528H基因最为常见。目前国内外对Hypo PP的相关研究也仅局限于细胞水平及离子通道的电生理改变,对于相关突变是如何导致低血钾及周期性麻痹的发生并未做出令人满意的解释。本课题组选择人类代表性突出的Ca V1.1-R528H突变,应用Red/ET技术和FLP/frt位点特异性重组系统在前期实验中已经成功的创建了Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠模型。而本实验将对该模型能否作为研究Hypo PP疾病的动物模型做出评估,并对其相关机制进行探讨,以期从整体动物水平来探索Hypo PP的发病机制,为临床治疗提供证据。方法1.检测Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠部分生化指标:选择20只野生型C57BL/6J小鼠(8周龄,雌雄各半)及20只Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠(8周龄,雌雄各半),检测丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、血肌酐(Cr)、电解质(K+、Na+、Cl-)等指标;2.验证干化学法测定微量鼠尾血电解质的可行性:使用干化学法检测Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠静脉血及鼠尾血电解质(K+、Na+、Cl-),并与C57BL/6J小鼠进行比较,计算电解质分析仪的精密度及其相关性。3.观察肾上腺素对Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠血钾的影响:选择野生型C57BL/6J小鼠及Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠(雄性,8周龄,各32只),按2×4析因设计方案进行分组,分为8组(n=8):正常对照组、正常低剂量组、正常中剂量组、正常高剂量组、突变对照组、突变低剂量组、突变中剂量组、突变高剂量组,分别注射生理盐水、肾上腺素(200ug/kg、250ug/kg、300ug/kg)及U0126(MEK抑制剂),分别记录注射前0min(基线值)和注射后10、20、30、40、50、60min时的血钾值。4.探讨肾上腺素降低血钾的相关机制:选择野生型C57BL/6J小鼠及Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠(雄性,8周龄,各8只),按2×2析因设计方案进行分组,分为4组(n=8):对照组(正常对照)、u0126组、肾上腺素组(正常中剂量组)、u0126+肾上腺组,分别注射生理盐水、肾上腺素及U0126(MEK抑制剂),血钾记录方法同上。结果1.野生型C57BL/6J小鼠组,雌雄小鼠之间生化指标无差异(P0.05),Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠组,雌雄小鼠之间生化指标亦无差异(P0.05),两组间,同性别小鼠比较,也无统计学差异(P0.05),说明该突变基因未对Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠的生化性能产生影响,且野生型C57BL/6J小鼠可以成为后续实验良好的参照标本。2.干化学法测定静脉血、鼠尾血电解质和湿化学法测定静脉血电解质三项结果比较后,差异无统计学意义(P0.05),后两者进行相关性分析,得出Na+、K+、Cl-的相关系数分别为0.977、0.897、0.981,具有良好相关性,证实了干化学法测定微量鼠尾血电解质是可行的。3.在相同处理因素前提下,突变因素对血钾有显著影响(P0.05),给药因素对血钾亦有显著影响(P0.05),但突变与给药的二级交互作用无统计学差异(P0.05):(1)野生型C57BL/6J小鼠组:与基线值相比,对照组血钾无明显变化(P0.05);肾上腺素组血钾下降(P0.05);不同剂量肾上腺组之间相比,无显著统计学差异(P0.05),无量-效关系;(2)Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠组:与基线值相比,对照组血钾无明显变化(P0.05);肾上腺素组血钾下降(P0.05);不同剂量肾上腺组之间相比,无显著统计学差异(P0.05),无量-效关系;(3)对两组小鼠相同剂量肾上腺素组比较,Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠血钾降低幅度较野生型C57BL/6J小鼠显著,差异有统计学意义(P0.05)。4.肾上腺素因素对血钾有显著影响(P0.05),抑制剂U0126因素对血钾亦有显著影响(P0.05),但肾上腺与抑制剂U0126的二级交互作用无统计学差异(P0.05):(1)与基线值相比,对照组、U0126、U0126+肾上腺组血钾无明显变化(P0.05),且三组之间进行比较差异无统计学意义(P0.05);(2)肾上腺素组血钾下降(P0.05);且与对照组、U0126组、U0126+肾上腺组相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论1.建立了干化学法重复检测微量鼠尾血电解质的方法,解决了小鼠反复检测血钾的难题,为本实验提供了基础,也为其他类似实验提供了参考;2.证实Cchl1a3-R528H基因是Hypo PP的致病突变,Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠作为Hypo PP疾病动物模型是成功的;3.首次在整体动物水平证实肾上腺素在骨骼肌细胞中是通过ERK信号通路激活Na+泵活性,促进钾向细胞内转移来降低血钾。
【关键词】：低钾性周期性麻痹 基因敲入 血钾 肾上腺素 ERK信号通路
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R-332;R591.1
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-19
• 材料与方法19-22
• 结果22-29
• 讨论29-37
• 结论37
• 参考文献37-44
• 附录：个人简介44-45
• 致谢45-46
• 综述：激素在低钾性周期性麻痹中作用机制的研究进展46-54
• 参考文献52-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 姚合斌;高荣凯;王晓英;黄火高;乔媛媛;尚健;尹义存;;应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略[J];海军总医院学报;2010年02期

2 陈冬梅;余叶蓉;;超重/肥胖患者高胰岛素血症与低钾周期性瘫痪的关系研究[J];四川大学学报(医学版);2013年04期

3 杨建岭;顾淑萍;陈臣;王铸钢;许燕;费俭;;用Red/ET重组酶构建基因打靶载体[J];生物工程学报;2006年06期

4 贾晓静;;低钾型周期性瘫痪国内外研究现状[J];中国老年学杂志;2012年02期

5 甘淑芳;;甲状腺功能亢进合并低钾性周期性麻痹68例临床分析[J];中国医疗前沿;2013年18期

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本文编号：314476