SIL-36R的鉴定、克隆及SIL-36R与IL-36Ra抑制IL-36诱导的REG3A的功能研究

发布时间：2017-04-24 10:02

  本文关键词：SIL-36R的鉴定、克隆及SIL-36R与IL-36Ra抑制IL-36诱导的REG3A的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞介素36(IL-36)是重要的免疫调节因子,包括IL-36α IL-36β和IL-36γ三个亚型。IL-36通过结合并激活其受体IL-36R启动下游促炎症信号通路诱导机体的炎症应答,参与机体的固有免疫调节和宿主防御。IL-36R是IL-1R家族的成员,该家族的信号通路通常有两种负向调节机制,一种是受体拮抗蛋白与配体竞争性结合受体,另一种是胞外的可溶性受体或细胞膜上的诱饵受体与主要受体竞争性结合配体,从而抑制信号通路。IL-36受体拮抗蛋白IL-36Ra可竞争性地结合IL-36R但不启动信号传导,发挥负向调节信号通路的功能,但是IL-36R的可溶性受体或诱骗受体形式至今未见报道。作为在皮肤组织中高表达的细胞因子,IL-36及IL-36Ra在皮肤炎症调节中的生物学功能已被广泛研究,然而它们在皮肤伤口愈合中的具体作用还未被研究。本研究中,我们首先检测了IL-36和IL-36Ra在小鼠皮肤伤口部位的表达情况,发现在皮肤伤口部位IL-36和IL-36Ra的表达均显著上调,其中IL-36γ表达上调的时间最早。同时也检测了皮肤伤口中RegⅢγ的表达情况,发现在野生型小鼠皮肤伤口中,RegⅢγ的表达在伤口愈合的前期上升,在后期下降；而在IL-36Ra缺失的小鼠皮肤伤口中,RegⅢγ的表达在伤口愈合的整个过程中持续性上调。这些结果表明皮肤中IL-36和IL-36Ra与RegⅢγ的表达及皮肤伤口愈合之间存在相关性。为了确定IL-36γ是否诱导REG3A的表达,我克隆、表达并纯化了人的IL-36γ和IL-36Ra重组蛋白。在体外用IL-36γ刺激皮肤角质形成细胞,发现IL-36γ能够诱导角质形成细胞中REG3A的表达,并促进伤口愈合；当IL-36Ra和IL-36γ共刺激角质形成细胞,发现IL-36Ra抑制IL-36γ诱导的REG3A的表达。这些结果证明了IL-36γ通过诱导REG3A的表达促进伤口愈合,而IL-36Ra则对这一过程进行负调控。此外,我从人皮肤角质形成细胞中首次鉴定并克隆了一种截短形式的IL-36R剪接变体一—sIL-36R,当在角质形成细胞中超表达sIL-36R后,发现IL-36γ不再能够诱导REG3A的表达。表明sIL-36R具有抑制IL-36γ诱导的REG3A的表达并抑制IL-36γ促进的伤口愈合的功能。总之,我们的研究证明了IL-36Ra在皮肤角质形成细胞表达REG3A及伤口愈合调控中的作用,首次鉴定克隆了新的受体sIL-36R并对其在皮肤伤口愈合中的功能进行了初步研究。我们的研究为临床治疗皮肤伤口不愈合提供了新的潜在的治疗靶点,我们的发现有望填补IL-36信号通路中没有胞外可溶性受体这一研究空白。
【关键词】：IL-36 IL-36Ra sIL-36R REG3A 伤口愈合
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 综述12-30
• 1 IL-1家族及其受体概述12-15
• 2 IL-3615-21
• 2.1 IL-36的发现15-16
• 2.2 IL-36的来源16
• 2.3 IL-36的结构16
• 2.4 IL-36的生物学功能16-17
• 2.5 IL-36与炎症性疾病17-21
• 3 IL-36Ra21-25
• 3.1 IL-36Ra的发现21-22
• 3.2 IL-36Ra的来源22
• 3.3 IL-36Ra的结构22-23
• 3.4 IL-36Ra的生物学功能23
• 3.5 IL-36Ra与银屑病23-25
• 4 IL-36R25-29
• 4.1 IL-36R的发现25-26
• 4.2 IL-36R的来源26
• 4.3 IL-36R的结构26-27
• 4.4 IL-36R信号通路27-28
• 4.5 IL-36R及其信号通路的生物学功能28-29
• 5 总结与展望29-30
• 第二章 sIL-36R的鉴定、克隆及sIL-36R与IL-36Ra抑制IL-36诱导的REG3A的功能研究30-75
• 1 引言30-32
• 2 实验材料32-38
• 2.1 实验试剂32-34
• 2.2 实验耗材34
• 2.3 实验仪器34-35
• 2.4 细胞株35
• 2.5 菌株35
• 2.6 质粒35-36
• 2.7 引物36-37
• 2.8 抗体37
• 2.9 相关计算机软件37
• 2.10 数据分析37-38
• 3 实验方法38-51
• 3.1 细菌的培养与保存38
• 3.2 质粒提取38
• 3.3 基因克隆38-42
• 3.4 蛋白的诱导表达与纯化42-44
• 3.5 细胞培养44
• 3.6 细胞总RNA提取与反转录44-45
• 3.7 慢病毒质粒构建、包装与感染45-48
• 3.8 细胞转染48-49
• 3.9 细胞总蛋白提取与免疫印迹49-51
• 4 结果与分析51-71
• 4.1 IL-36γ激活IL-36R诱导REG3A的表达51-60
• 4.2 IL-36Ra拮抗IL-36γ诱导的REG3A的表达60-66
• 4.3 sIL-36R抑制IL-36γ诱导的REG3A的表达66-71
• 5 总结与讨论71-75
• 参考文献75-82
• 附录Ⅰ 缩略词表82-84
• 附录Ⅱ 试剂配制84-86
• 致谢86

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本文编号：323957