屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究

发布时间：2017-04-29 19:19

  本文关键词：屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的构建编码屋尘螨变应原Derp1和Derp2的T细胞表位融合肽嵌合基因的原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行大规模的诱导表达和纯化,并对纯化产物的特异性免疫治疗效果进行分析。 方法1)将Der p1和Der p2的8个T细胞表位用“GPGPG"序列间隔串联为T1-8融合肽,利用DNA重组技术合成T1-8融合肽基因并插入质粒pET-28a(+),构建pET-28a(+)-T1-8载体,限制性内切酶双酶切验证并测序。2)将重组表达载体pET-28a(+)-T1-8转化到大肠埃希菌E.coil BL21(DE3)感受态中,菌落PCR筛选阳性克隆菌。3)用IPTG小剂量诱导表达,优化条件后进行大剂量诱导表达并纯化,SDS-PAGE和Western blot (WB)验证表达和纯化产物。4)将40只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,分别为阴性对照组(PBS组)、阳性对照组(Asthma组)变应原rDer p1和rDer p2混悬液治疗组(rDer p1/rDer p2组)以及T1-8融合肽治疗组(T1-8组)。用屋尘螨粗提取液(HDM)致敏小鼠建立哮喘模型,PBS组均以PBS缓冲液代替；两组治疗组分别于小鼠致敏第25天至27天雾化致敏前30min行背部皮下注射相应治疗蛋白；最后一次雾化激发24h后,收集各组小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)以及脾细胞培养上清(SSCC)。ELISA法检测BALF和SSCC中特异性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17以及血清中变应原特异性IgE、IgG、IgG2。抗体水平,并行肺组织切片HE染色。 结果1)BamHI/NotI双酶切结果以及测序结果显示成功构建pET-28a(+)-T1-8载体。2)菌落PCR结果显示成功转化至E.coil BL21(DE3)感受态中。3)SDS-PAGE以及WB验证表明该质粒在大肠埃希菌BL21中成功表达。4)ELISA法检测结果显示,T1-8组和rDer p1/rDer p2组与Asthma组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17均降低,IFN-γ、IL-10均升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,差异均有统计学意义(P0.05)；T1-8组与rDer p1/rDer p2组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17降低,IFN-γ、IL-10升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,均有统计学意义(P0.05)。肺组织切片观察表明：T1-8组和rDer p1/rDerp2组肺部炎症较Asthma组明显减轻,且炎性细胞浸润显著减少,气道上皮结构重塑；T1-8组与rDer p1/rDer p2组相比,气道上皮结构与PBS组更为相近。结论成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行了大规模表达和纯化；表达的T1-8融合肽对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗后可有效改善小鼠变态反应性气道及肺部炎症,可作为屋尘螨哮喘患者特异性免疫治疗的候选疫苗,以待进一步的研究。
【关键词】：屋尘螨 Der p1 Der p2 T细胞表位 特异性免疫治疗
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R384.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注释说明清单13-17
• 引言17-22
• 第一部分 Derp1/Derp2T表位融合肽基因的合成及原核表达载体的构建、表达和纯化22-49
• 1 研究内容22-23
• 2 材料与方法23-33
• 2.1 重组基因23-24
• 2.2 质粒与引物24
• 2.2.1 质粒24
• 2.2.2 引物24
• 2.3 主要试剂24-26
• 2.4 主要仪器26-28
• 2.5 主要试剂的配制28-33
• 3 实验步骤33-41
• 3.1 重组质粒的提取33-34
• 3.2 重组质粒pET-28a(+)-T_(1-8)的双酶切鉴定34
• 3.3 BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞的制备和转化34-35
• 3.3.1 感受态细胞的制备34
• 3.3.2 转化34-35
• 3.4 pET28a(+)-T_(1-8)菌落PCR、筛选阳性菌及测序35-36
• 3.5 T_(1-8)融合肽的小剂量诱导表达36
• 3.6 T_(1-8)融合肽的SDS-PAGE分析36-37
• 3.7 T_(1-8)融合肽的大剂量诱导表达37
• 3.8 T_(1-8)融合肽的纯化37-38
• 3.9 纯化产物的免疫印记(western blot)分析38-39
• 3.10 改良型Bradford's法定量重组变应原T1-8融合肽浓度39-41
• 4 结果41-47
• 4.1 质粒pET-28a(+)-T_(1-8)的双酶切鉴定43
• 4.2 PCR扩增筛选阳性转化子并测序43-44
• 4.3 T_(1-8)融合肽小剂量诱导表达44-45
• 4.4 T_(1-8)融合肽大剂量诱导表达和纯化45-46
• 4.5 纯化产物的免疫印迹(western blot)鉴定46
• 4.6 T_(1-8)融合肽浓度测定46-47
• 5 讨论47-49
• 第二部分 T_(1-8)融合肽疫苗对哮喘小鼠免疫治疗的效果分析49-65
• 1 研究内容49-50
• 2 材料与方法50-52
• 2.1 实验动物50
• 2.2 实验材料50
• 2.3 主要试剂50
• 2.4 主要试剂配制50-52
• 3 实验步骤52-55
• 3.1 尘螨粗提取液的制备52
• 3.2 实验动物分组52
• 3.3 小鼠哮喘模型的建立52
• 3.4 对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗52-53
• 3.5 实验标本取材及指标检测53-55
• 3.5.1 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集和检测53
• 3.5.2 血清特异性IgE、IgG_1和IgG_(2a)抗体含量的测定53
• 3.5.3 脾细胞培养53-54
• 3.5.4 肺组织病理切片HE染色54-55
• 4 结果55-63
• 4.1 尘螨粗提取液浓度的测定55
• 4.2 各组小鼠症状和体征的改变55
• 4.3 ELISA法测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中特异性细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的水平55-57
• 4.4 ELISA法测定血清中特异性IgE、IgG_1和IgG_(2a)的含量57-59
• 4.5 ELISA法测定脾细胞培养上清(SSCC)抗原特异性IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的水平59-61
• 4.6 肺组织切片HE染色61-63
• 5 讨论63-65
• 结论65-66
• 参考文献66-74
• 致谢74-75
• 作者简介及读研期间主要科研成果75

【参考文献】

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  本文关键词：屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：335480