Martentoxin的表达体系优化及其与BK通道孔区的交互结构模拟
发布时间：2017-04-30 05:17
本文关键词：Martentoxin的表达体系优化及其与BK通道孔区的交互结构模拟，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：大电导钙激活(large-conductance Ca2+-activated K+channel,BK)钾通道是广泛分布于兴奋性和非兴奋性细胞中的一种受电压和钙离子双重门控的钾离子通道,具有调节细胞兴奋性、控制细胞增殖迁移和渗透压等生理功能。Martentoxin源于我国独有产毒物种东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,Bm K),是一种由37个氨基酸残基构成的短链多肽毒素。研究表明,Martentoxin对BK通道的药理选择性高于其它各类型的电压门控钾通道(Kv)近千倍。迄今为止,BK通道亚型特异性药物工具仍极度稀缺,阐明Martentoxin与BK通道间的相互作用模式将有助深入剖析BK通道结构与功能及相关病理学成因的分子机制。本论文工作借助分子生物学和计算机模拟方法,1、针对Martentoxin原核表达,选用了不同的5种表达载体以及5种感受态菌株进行多重组合优选,并针对诱导温度、诱导时间、诱导物浓度、亲和时间以及载量等表达条件进行了分类筛选,优选出的表达条件为:以p GEX-4T-3为载体,以Rosetta菌株为宿主菌,诱导温度为16度,诱导时间24h,诱导物浓度0.5 m M,每升菌液3小时与1 ml填料的亲和;2、选用适合通道体外表达的载体p QE30系统,以来源于原核生物变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)钾通道Kcs A为分子骨架,构建了包含BK通道离子透过孔区微结构的Kcs A-BK膜蛋白嵌合体,并在M15菌株大肠杆菌表达系统中实现了高效表达。运用Discovery Studio计算机模拟,对BK通道孔区进行了建模优化及评估。本论文研究结果为探究BK通道药物作用新靶点以及设计相关通道疾病治疗药物垫铺了特异探针的保障前提、方法学的基础与理论拓展的空间。
【关键词】：大电导钙激活钾通道 Martentoxin KcsA-BK 体外表达体系优选 计算机模拟
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363;Q78
【目录】：
- 摘要6-7
- ABSTRACT7-12
- 第一章 绪论12-20
- 1.1 钾离子通道简介12-14
- 1.2 BK通道的研究进展14-15
- 1.3 短链蝎毒素的研究进展15-18
- 1.4 Martentoxin：特异性神经型BK通道阻断剂18-19
- 1.5 本课题的研究意义19-20
- 第二章 Martentoxin表达及纯化体系的优化20-49
- 2.1 材料20-26
- 2.1.1 实验材料与试剂20-21
- 2.1.2 实验仪器与设备21-22
- 2.1.3 主要实验用液配方22-26
- 2.2 方法26-35
- 2.2.1 表达载体的构建26-30
- 2.2.2 Martentoxin的表达及纯化30-34
- 2.2.3 r Martentoxin的药理学活性检测34-35
- 2.3 结果35-47
- 2.3.1 载体的构建35-37
- 2.3.2 五种载体的比较筛选37-39
- 2.3.3 Martentoxin的表达条件39-42
- 2.3.4 Martentoxin的亲和层析柱分离42-44
- 2.3.5 目的蛋白Martentoxin的分离纯化44-45
- 2.3.6 r Martentoxin在LB和M9培养基中的提纯并比较45-46
- 2.3.7 Martentoxin药理活性的检测46-47
- 2.4 讨论47-49
- 第三章 BK通道孔区的结构模拟49-63
- 3.1 材料49
- 3.2 方法49-52
- 3.2.1 p QE30-Kcs A-BK表达质粒的构建49-50
- 3.2.2 Kcs A-BK嵌合体蛋白的表达及纯化50-51
- 3.2.3 表面等离子共振（SPR）51-52
- 3.3 结果52-60
- 3.3.1 Kcs A-BK的表达纯化52-53
- 3.3.2 Kcs A-BK的药理结合活性鉴定53-55
- 3.3.3 BK通道建模的序列一致性分析55-56
- 3.3.4 BK通道孔区模型的选取56-58
- 3.3.5 BK模型结构评估及优化58-60
- 3.4 讨论60-63
- 参考文献63-67
- 作者在攻读硕士学位期间的学术成果67-68
- 作者在攻读硕士学位期间所参与的项目68-69
- 致谢69
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