细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究
发布时间：2017-04-30 11:14
本文关键词：细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：【研究背景和意义】病原体诱导的细胞死亡是哺乳动物防御系统的一个至关重要的部分。已经发现RIP3依赖的细胞程序性坏死参与到了机体防御外来入侵病原体的过程中,但病原体激活RIP3依赖的细胞程序性坏死的具体分子机制尚不清楚。【研究目的】探究HSV-1诱导细胞程序性坏死的分子机制,以及这种程序性坏死方式如何在机体抗病毒中发挥作用。【研究方法】为了筛选能够引发RIP3-依赖性细胞坏死的病毒,我们利用两株牛痘病毒和两株HSV-1感染WT和RIP3缺失的MEF细胞,检测细胞的存活率;为了检测了RIP3的缺失是否影响了病毒的入侵和复制,用HSV-1感染了野生型和RIP3缺失的MEF细胞,之后通过蛋白免疫印迹和荧光定量PCR检测病毒蛋白和基因的表达水平。为了检测RIP3缺失对NF-κB信号通路的影响,利用蛋白免疫印迹检测MEF细胞和RIP3缺失的MEF细胞感染HSV-1后p-IκBα水平;为了检测TNFR,TLR3,Nectin-1,MLKL,CYLD和DAI是否参与到这条信号通路,通过对TNFR1 KO,TNFR1/2 DKO,TLR3 KO细胞感染HSV-1检测存活率,通过RNAi沉默Nectin-1,CYLD后感染HSV-1检测存活率,通过构建MLKL shRNA细胞系和通过CRISPR/Cas9技术构建DAI KO细胞系,感染HSV-1后检测存活率;在RIP3缺失的MEF细胞上构建能稳定表达HA和Flag标签的RIP3的细胞系,对细胞感染病毒后,利用RIP3的免疫共沉淀,将产物进行质谱分析去寻找参与激活HSV-1诱导的细胞坏死的关键作用蛋白;通过逆转录病毒体系使ICP6在细胞内过表达以检测ICP6蛋白的表达是否足以激活RIP3/MLK依赖的细胞坏死;对野生型小鼠和和RIP3 KO小鼠腹腔注射HSV-1,检测小鼠脑,脾,肝,血清中的病毒滴度,对小鼠肝脏进行切片及免疫组化,对小鼠注射一次或两次病毒后,监控存活率,以此确定RIP3在小鼠抵御病毒复制和致病中的作用。【研究结果】(1)HSV-1的感染激活RIP3-依赖性细胞坏死(2)细胞凋亡不参与到HSV-1激活的细胞死亡(3)RIP3的缺失不影响HSV-1入侵细胞以及病毒自身的复制(4)RIP3的缺失不影响HSV-1激活的NF-κB信号活性(5)HSV-1感染诱发的细胞程序性坏死不依赖TNFR,CYLD,TLR3,但依赖于Nectin-1(6)HSV-1感染诱发的细胞程序性坏死不依赖于DAI(7)MLKL是HSV-1感染诱发的细胞程序性坏死依赖于RIP3的底物MLKL(8)病毒蛋白ICP6参与到HSV-1激活的RIP3免疫复合体中(9)ICP6与RIP3通过RIP同源作用域(RHIM)相互作用(10)ICP6对于HSV-1诱导的细胞程序性坏死是必须的(11)ICP6的表达足以激活RIP3/MLKL介导的细胞程序性坏死(12)ICP6激活的细胞程序性坏死依赖于ICP6和RIP3的RHIM结构域及RIP3的激酶活性(13)RIP3介导的细胞程序性坏死帮助机体抵御HSV-1(14)RIP3介导的细胞程序性坏死帮助宿主抵抗HSV-1的复制和造成的致死【结论】综上所述,我们的工作首次发现了RIP3识别HSV-1病毒ICP6进而启动宿主细胞程序性坏死的分子机制,并揭示了RIP3-依赖性细胞坏死在机体抗HSV-1病毒感染中的重要生理学功能。
【关键词】：细胞程序性坏死 HSV-1 ICP6 RIP3 MLKL
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.25
【目录】：
- 中文摘要4-6
- Abstract6-8
- 缩略表8-10
- 前言10-13
- 材料与方法13-23
- 一．材料13-17
- 二．方法17-23
- 结果23-45
- 1．HSV-1 感染激活RIP3-依赖性细胞坏死23-25
- 2. 细胞凋亡不参与到HSV-1 激活的细胞死亡25-26
- 3. RIP3的缺失不影响HSV-1 入侵细胞以及病毒自身的复制26-27
- 4. RIP3的缺失不影响HSV-1 激活的NF-κB信号活性27-28
- 5. HSV-1 感染诱发的细胞程序性坏死不依赖TNFR，CYLD，，TLR3，但依赖于Nectin-128-30
- 6. HSV-1 感染诱发的细胞程序性坏死不依赖于DAI30-32
- 7. HSV-1 感染诱发的细胞程序性坏死依赖于RIP3的底物MLKL32-33
- 8. 病毒蛋白ICP6参与到HSV-1 激活的RIP3免疫复合体中33-34
- 9. ICP6与RIP3通过RIP同源作用域(RHIM)相互作用34-36
- 10. ICP6对于HSV-1 诱导的细胞程序性坏死是必须的36-38
- 11. ICP6的表达足以激活RIP3/MLKL介导的细胞程序性坏死38-40
- 12. ICP6激活的细胞程序性坏死依赖于ICP6和RIP3的RHIM结构域及RIP3的激酶活性40-42
- 13. RIP3介导的细胞程序性坏死帮助机体抵御HSV-142-43
- 14. RIP3介导的细胞程序性坏死帮助宿主抵抗HSV-1 的复制和造成的致死43-45
- 讨论45-48
- 结论48-49
- 参考文献49-53
- 综述 细胞程序性坏死的最新研究进展53-62
- 综述参考文献58-62
- 攻读学位期间本人出版和公开发表的论著、论文62-63
- 致谢63-64
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