结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶（SapM）对小鼠巨噬细胞自噬的抑制作用

发布时间：2017-04-30 12:01

  本文关键词：结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶（SapM）对小鼠巨噬细胞自噬的抑制作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：建立可以稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(RFP-GFP-LC3)的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为自噬研究提供材料。研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)对小鼠巨噬细胞自噬的影响,探究Rab7在结核杆菌毒力因子SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用。方法：1用分子克隆的方法构建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重组质粒载体,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒液上清后感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,分别用荧光显微镜和流式细胞仪分析感染效率。饥饿处理稳定感染的细胞,荧光显微镜下观察细胞内的RFP-GFP-LC3斑点。2.分别用SapM.渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-RAW264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关性蛋白轻链3(LC3)Ⅱ水平；再用SapM处理GFP-LC3-RAW264.7细胞后加氯喹,Western blot法检测LC3Ⅱ水平。3.siRab7转染RAW264.7细胞,用蛋白免疫印记检测P62。mCherry-SapM转染RAW264.7后免疫组化分析SapM与Rab7共定位情况,免疫共沉淀分析SapM与Rab7的关系。用三种SapM的突变体SapM△arcA, SapM△FReD和SapM△CT转染RAW264.7细胞,分析SapM的不同突变体与Rab7的关系。结果：1.成功构建了慢病毒载体pLV-CMV-RFP-GFP-LC3,经感染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7细胞；2.SapM和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高,在SapM处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。3.siRab7处理后,细胞P62水平显著增高；免疫组化显示SapM与Rab7在胞内共定位：免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀；三种不同突变形式的SapM中,只有SapM△cT不能与Rab7相互作用。结论：稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株成功建立,为自噬的研究建立了细胞平台。SapM可阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用。
【关键词】：稳定表达 RAW264.7细胞 结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM) 自噬 Rab7 融合
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 引言13-15
• 第一部分 构建稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞系15-26
• 1.1 引言15
• 1.2 材料15-17
• 1.3 方法17-20
• 1.4 结果20-25
• 1.5 讨论25-26
• 第二部分 结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)抑制小鼠巨噬细胞自噬26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 材料26-27
• 2.3 方法27-29
• 2.4 结果29-35
• 2.5 讨论35-37
• 第三部分 Rab7在SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用37-48
• 3.1 引言37
• 3.2 材料37-38
• 3.3 方法38-39
• 3.4 结果39-46
• 3.5 讨论46-48
• 结论48-49
• 参考文献49-53
• 后记或致谢53-54
• 作者简介及读研期间主要科研成果54-55

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