风疹病毒亚单位疫苗的制备与E1蛋白抗体结合位点关键氨基酸的定位研究
发布时间：2021-08-28 21:36
第一部分风疹病毒E72-296亚单位疫苗的制备和有效性评价研究背景风疹病毒（Rubella virus, RV）是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,为单股正链的RNA病毒,通常在一般人群中引起温和的疾病,但孕妇感染RV能导致流产、死胎或胎儿出生缺陷,即先天风疹综合征（Congenital rubella syndrome,CRS）。目前使用的RV疫苗均为减毒活疫苗,接种孕妇存在安全隐患,接种AIDS儿童和免疫缺陷人群可导致严重的并发症。风疹基因工程亚单位疫苗由于其安全性高于减毒活疫苗,可接种孕妇、AIDS儿童和免疫缺陷人群,是目前风疹疫苗的研究热点。RV的E1蛋白是RV的包膜糖蛋白,分子上包含重要的T细胞、B细胞和抗体中和表位,在动物体内能够引起体液免疫和一定的细胞免疫。E1蛋白上含有四个中和抗体表位,分别是E1（221-239）, E1（234-252）, E1（254-285）和E1（272-285）。其中,E1（221-239）被认为是主要的中和表位,E1（272-285）被认为含有T细胞表位和诱导中和抗体的表位。有多个研究用原核、毕赤酵母和CHO细胞等系统表达了包含这些表位的E1...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：155 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
毕赤酵母菌密码子利用率图
了毕赤酵母菌的密妈子利用率情况）对E1蛋白胞外E (E,-446)基因进行密码子优化，优化方案由上海生工完成，优化基因的密码子利用率如图2,去除了表达率小于10%的密码子，增加了毕赤酵母菌利用密码子的频率，为构建表达载体的目的基因建立了优化基因模板。Jlf jJL li—s § s f a ti a a Y ^ t § ? y ￥ a a s S s s stM-J—■MWIIll I ? i■丨…Willi I ■■ I gA llllllllll ^ Ml—I iL ^llWIMIWW； L1 r I |>--^ p-*y>l 1<3?o -r?C3 Oct -an ■? 03 oa "O-a?rt-si ■OKJ -oai -sfcca -a -=?3 oa -sja- 1=1 厂 "I I?' ！^“丨 i 1? 丨’‘‘'I? 3 m 發努至 ：發—g § g ？ S ？ § S f S ^ S ？ § J ^ S ^ S ？|'1 I ‘ ‘ '| V Vf-, "ifrrHlTV^ r图1毕赤酵母菌密码子利用率图50
GACCTTAT基因测序结果与目标片段序列进行比对发现两者完全吻合，表明PZaA-E72-:!%、pGAPZaA-E72-304、pGAPZaA-E25-304 和 pGAPZaA-E25-395 表达构建成功，可以进行蛋白表达。(四）E72-2%重组蛋白在毕赤酵母菌分泌上清中的表达取Zeocin蹄选阳性克隆，接种于1 L改良YPD培养基中，300 r/min摇床，每天取培养液15 ml，4 °C , 10000 r/min离心10 min,将10 m丨上清浓缩后取20|al浓缩样品进行SDS-PAGE检测。如图4所示，￡72-2%重组蛋白随达时间的延长表达量增加，从6天开始杂蛋白表达量增加。取5天浓缩样行SDS-PAGE和Western blot检测，E72-296重组蛋白能与抗RV E1抗体特异，E72-304、E25-304和E25-395重组蛋白未能在上清中表达(图5)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[J]. 张伍魁,范清林,宋礼华. 中国生物工程杂志. 2006(01)
[2]风疹病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展[J]. 吴冰,王志玉. 病毒学报. 2005(05)
[3]风疹病毒JR23株糖蛋白E1在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析[J]. 温红玲,王志玉,宋艳艳,任桂杰,陶泽新,宋绍霞,王桂亭,许洪芝. 中华微生物学和免疫学杂志. 2005(03)
[4]乳酸菌源有机硒对肝损伤小鼠脾脏脂质过氧化和NK细胞活性的保护效应研究[J]. 陈龙,朱善良,曹萌. 实验生物学报. 2005(01)
[5]风疹病毒分子流行病学研究[J]. 薛永磊,王志玉,王小凡. 中华实验和临床病毒学杂志. 2004(04)
[6]风疹病毒包膜糖蛋白E1酵母表达载体的构建[J]. 温红玲,王志玉,王战勇,任桂杰. 山东大学学报(医学版). 2004(05)
[7]风疹病毒分子生物学与基因工程疫苗研究进展[J]. 温红玲,王志玉. 国外医学(微生物学分册). 2004(01)
[8]风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆与序列分析[J]. 王志玉,薛永磊,王小凡,宋艳艳. 中华微生物学和免疫学杂志. 2002(06)
[9]外周血淋巴细胞携带风疹抗原与中枢神经感染风疹病毒的关系[J]. 姚苹,宋艳艳,许洪芝,王桂亭,刘言训,王志玉. 中华微生物学和免疫学杂志. 2000(05)
[10]乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达[J]. 周则迅,袁汉英,何炜,高卜渝,李育阳. 复旦学报(自然科学版). 2000(03)
本文编号：3369291
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：155 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
毕赤酵母菌密码子利用率图
了毕赤酵母菌的密妈子利用率情况）对E1蛋白胞外E (E,-446)基因进行密码子优化，优化方案由上海生工完成，优化基因的密码子利用率如图2,去除了表达率小于10%的密码子，增加了毕赤酵母菌利用密码子的频率，为构建表达载体的目的基因建立了优化基因模板。Jlf jJL li—s § s f a ti a a Y ^ t § ? y ￥ a a s S s s stM-J—■MWIIll I ? i■丨…Willi I ■■ I gA llllllllll ^ Ml—I iL ^llWIMIWW； L1 r I |>--^ p-*y>l 1<3?o -r?C3 Oct -an ■? 03 oa "O-a?rt-si ■OKJ -oai -sfcca -a -=?3 oa -sja- 1=1 厂 "I I?' ！^“丨 i 1? 丨’‘‘'I? 3 m 發努至 ：發—g § g ？ S ？ § S f S ^ S ？ § J ^ S ^ S ？|'1 I ‘ ‘ '| V Vf-, "ifrrHlTV^ r图1毕赤酵母菌密码子利用率图50
GACCTTAT基因测序结果与目标片段序列进行比对发现两者完全吻合，表明PZaA-E72-:!%、pGAPZaA-E72-304、pGAPZaA-E25-304 和 pGAPZaA-E25-395 表达构建成功，可以进行蛋白表达。(四）E72-2%重组蛋白在毕赤酵母菌分泌上清中的表达取Zeocin蹄选阳性克隆，接种于1 L改良YPD培养基中，300 r/min摇床，每天取培养液15 ml，4 °C , 10000 r/min离心10 min,将10 m丨上清浓缩后取20|al浓缩样品进行SDS-PAGE检测。如图4所示，￡72-2%重组蛋白随达时间的延长表达量增加，从6天开始杂蛋白表达量增加。取5天浓缩样行SDS-PAGE和Western blot检测，E72-296重组蛋白能与抗RV E1抗体特异，E72-304、E25-304和E25-395重组蛋白未能在上清中表达(图5)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[J]. 张伍魁,范清林,宋礼华. 中国生物工程杂志. 2006(01)
[2]风疹病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展[J]. 吴冰,王志玉. 病毒学报. 2005(05)
[3]风疹病毒JR23株糖蛋白E1在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析[J]. 温红玲,王志玉,宋艳艳,任桂杰,陶泽新,宋绍霞,王桂亭,许洪芝. 中华微生物学和免疫学杂志. 2005(03)
[4]乳酸菌源有机硒对肝损伤小鼠脾脏脂质过氧化和NK细胞活性的保护效应研究[J]. 陈龙,朱善良,曹萌. 实验生物学报. 2005(01)
[5]风疹病毒分子流行病学研究[J]. 薛永磊,王志玉,王小凡. 中华实验和临床病毒学杂志. 2004(04)
[6]风疹病毒包膜糖蛋白E1酵母表达载体的构建[J]. 温红玲,王志玉,王战勇,任桂杰. 山东大学学报(医学版). 2004(05)
[7]风疹病毒分子生物学与基因工程疫苗研究进展[J]. 温红玲,王志玉. 国外医学(微生物学分册). 2004(01)
[8]风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆与序列分析[J]. 王志玉,薛永磊,王小凡,宋艳艳. 中华微生物学和免疫学杂志. 2002(06)
[9]外周血淋巴细胞携带风疹抗原与中枢神经感染风疹病毒的关系[J]. 姚苹,宋艳艳,许洪芝,王桂亭,刘言训,王志玉. 中华微生物学和免疫学杂志. 2000(05)
[10]乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达[J]. 周则迅,袁汉英,何炜,高卜渝,李育阳. 复旦学报(自然科学版). 2000(03)
本文编号：3369291
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