缺氧预处理后骨髓源神经干细胞联合BDNF治疗大鼠脑梗塞模型的实验研究

发布时间：2017-04-30 16:08

  本文关键词：缺氧预处理后骨髓源神经干细胞联合BDNF治疗大鼠脑梗塞模型的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究缺氧预处理后骨髓源神经干细胞(BMSCs-NSCs)联合脑源性神经生长因子(BDNF)立体定向移植治疗大鼠脑梗塞损伤的疗效;以及BMSCs-NSCs在体内外分化的特性,为高原地区脑梗塞的细胞移植治疗提供动物实验基础。方法:将72只SD大鼠随机分为缺氧预处理组和常氧两大组各36只,缺氧预处理组造模前先行急性低氧预处理(HPC)(模拟海拔5000m高度的低压氧舱行3d,每天3h),大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型成功后每个大组再分成三个亚组,每个亚组各12只,A组:BMSCs-NSCs+BDNF移植组;B组:BMSCs-NSCs移植组;C组:对照组(仅注射DMEM/F12培养基)。分别通过立体定向仪移移植入梗塞同侧尾状核内,并于3、7、14、21、28、35d进行神经功能缺损评分(包括平衡木测试、行走测试、抓握测试),断头取脑后再从形态学(梗死灶大小的变化)及组织学(免疫组织化学及免疫荧光染色)了解骨髓源性神经球分化情况,进行疗效观察。结果： 1.BMSCs在体外联合应用碱性成纤维生长因子(b FGF)、表皮生长因子(EGF)及B27诱导下形成的细胞球经CD133和Nestin检测证实为BMSCs-NSCs(本实验诱导成功)。2.BMSCs-NSCs经Nestin、MAP-2、GFAP、Galc抗原免疫荧光染色均呈阳性表达,证实SD大鼠BMSCs-NSCs在体外均能分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。3.体外BMSCs-NSCs分裂速度与培养基胎牛血清(FBS)相关,10%FBS和10%FBS+50ng/m L BDNF组分化为神经元比例分别为(22±2.4)个,(31±1.7)个,(P0.01),故添加BDNF可提高分化为神经元比例,荧光倒置显微镜下观察到添加BDNF后BMSCs-NSCs突触数目增多、长度增加,并促进连接。4.移植后大鼠神经功能第14d即开始明显改善,而第21d梗塞区迁移入Badu阳性表达细胞最多,但这些标志物的表达仍主要集中于细胞移植区,以GFAP表达阳性的星形胶质细胞为主。5.缺氧各组与对应常氧各组各检测指标间无显著性差异(P0.05)。无论缺氧处理组、还是常氧组,BMSCs-NSCs+BDNF组各检测指标间均显著高于BMSCs-NSCs组(P0.05);BMSCs-NSCs+BDNF组、BMSCs-NSCs植组各检测指标均高于对照组(P0.05)。 结论: 1.BMSCs在体外可诱导分化成BMSCs-NSCs,且在体内外均具有多向分化特性,可被诱导分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。2.体外BMSCs-NSCs分裂速度与培养基FBS一定浓度相关,BDNF在体内外均可显著提高分化为神经元的比例,在体外可增加BMSCs-NSCs突触数目、长度与突触连接,而在体内可促进功能性突触联系。3.移植14d后大鼠神经功能开始明显改善,而21d左右到达梗塞区内及分化的BMSCs-NSCs最多。添加BDNF可显著提高移植的疗效。4.缺氧预处理并不能促进外源性BMSCs-NSCs分化,但却能明显改善大鼠神经功能,缺氧预处理可能促进了内源性NSCs的增殖和分化。
【关键词】：缺氧预处理 骨髓源神经干细胞 BDNF 立体定向移植
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3;R-332
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-14
• 第2章 材料与方法14-21
• 2.1 实验材料14-15
• 2.1.1 实验动物14
• 2.1.2 主要试剂14-15
• 2.1.3 主要仪器15
• 2.1.4 主要溶液配制15
• 2.2 实验方法15-21
• 2.2.1 BMSCs-NSCs的分离、培养15-17
• 2.2.2 大脑中动脉缺血再灌注损伤模型的建立17
• 2.2.3 缺氧预处理17-18
• 2.2.4 实验分组18
• 2.2.5 骨髓源性神经球立体定向移植治疗大鼠缺血再灌注模型18
• 2.2.6 形态学及组织学观察18-20
• 2.2.7 统计学分析20-21
• 第3章 结果21-27
• 3.1 BMSCs的形态观察21
• 3.1.1 原代培养21
• 3.1.2 传代后21
• 3.2 骨髓源性球的形态观察21
• 3.3 骨髓源性神经球的CD133和Nestin检测结果21-22
• 3.4 BMSCs-NSCs的体外分化22
• 3.4.1 细胞形态及阳性细胞率22
• 3.4.2 移植骨髓源神经球的分化能力22
• 3.5 移植治疗后疗效观察22-27
• 3.5.1 BMSCs-NSCs的Brdu标记及迁移22-23
• 3.5.2 各治疗组大鼠神经功能评定23-24
• 3.5.3 BMSCs-NSCs在梗塞区的分化24-25
• 3.5.4 各治疗组不同时间点大鼠脑梗塞面积的观察(HE染色)25-27
• 第4章 讨论27-31
• 4.1 BMSCs-NSCs的体外分化特点及影响因素27
• 4.2 BMSCs-NSCs在体内迁移特点27-28
• 4.3 移植治疗各组大鼠神经功能评定与梗塞面积的观察 (HE染色)28
• 4.4 BMSCs-NSCs的体内分化特点28-29
• 4.5 大鼠缺氧预处理与常氧组疗效观察29-31
• 第5章 结论31-32
• 参考文献32-34
• 附录34-44
• 综述44-50
• 参考文献48-50
• 致谢50-51
• 作者简历51

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本文编号：337159