鼠源pEGFP-C1-TMEM88真核表达质粒的构建及其功能研究

发布时间：2022-01-06 21:25

　　目的构建鼠源真核表达载体pEGFP-C1-跨膜蛋白88质粒（pEGFP-C1-TMEM88）,并观察其对RAW264.7细胞中炎症因子分泌的影响和对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法在小鼠正常肝细胞株（AML-12）中提取RNA并且逆转录为cDNA,同时将引物稀释到10μmol/L,其余作为储备液。采用PCR技术扩增跨膜蛋白88（TMEM88）并鉴定,使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收。再对PCR产物及载体进行酶切回收,酶切片段连接后,进行连接产物的转化、挑菌、摇菌、质粒抽提。酶切鉴定后,送至测序鉴定。将构建好的质粒转染至小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7细胞中,通过MTT实验和流式细胞术检测其对细胞增殖和凋亡的影响,并用ELISA技术检测炎症因子:白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在RAW264.7细胞中的表达。结果测序结果显示pEGFP-C1-TMEM88真核表达质粒构建成功;MTT实验结果显示:48 h后过表达TMEM88组细胞的增殖率为（0.71±0.04）,显著低于对照组（0.94±0.06）（F=21.55,P&l... 

【文章来源】：安徽医科大学学报. 2019,54(12)北大核心

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

重组质粒 pEGFP-C1-TMEM88 的酶切鉴定

将pEGFP-C1-TMEM88表达质粒转染至RAW264.7细胞中,利用Western blot检测其蛋白表达情况。结果显示,过表达质粒组的TMEM88的蛋白表达量明显高于Control组(F=134.64,P<0.01);当用TMEM88抗体免疫印迹时,过表达TMEM88组分别在约17 ku(内源性TMEM88)和44 ku(GFP-TMEM88过表达,即27 ku + 17 ku)显现蛋白印迹,而Control组仅在约17 ku(内源性TMEM88)的显现蛋白印迹,表明pEGFP-C1-TMEM88能够成功表达,见图2。2.3 TMEM88对RAW264.7细胞增殖的影响

将生长对数期的RAW.264.7细胞中转染pEGFP-C1-TMEM88质粒,48 h后用凋亡试剂盒在流式仪上检测细胞凋亡率。结果显示,N组的细胞凋亡率为(6.72±0.92)%,Control组的细胞凋亡率为(7.78±1.67)%,过表达TMEM88组的细胞凋亡率为(11.52±1.43)%,显著高于Control组 (F=10.07, P<0.05),结果显示,过表达TMEM88后,能够促进RAW.264.7细胞的凋亡,见图4A、4B。2.5 TMEM88在RAW264.7细胞中对炎症因子分泌的影响

【参考文献】：
期刊论文
[1]TMEM88真核表达质粒的构建及其功能研究[J]. 倪升丽,胡富勇,李增,孟晓明,王学富,徐涛.  安徽医科大学学报. 2017(06)
[2]15-脱氧前列腺素J2对脂肪肝大鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达的影响[J]. 王璞,刘江文,仝德峰,崔涌.  临床荟萃. 2013(04)
[3]小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结[J]. 方瑶,毛旭虎.  现代生物医学进展. 2012(22)
[4]心力衰竭患者血清肿瘤坏死因子、白细胞介素6和白细胞介素6受体水平的测定及临床意义[J]. 陈哲林,许金诚.  广东医学院学报. 2002(04)
[5]TNFa、IL6与肝储备功能关系的探讨[J]. 吴泽建,雷正明,黎靖,甘西仑.  泸州医学院学报. 2001(06)



本文编号：3573196