核因子Nrf2负向调节肺炎支原体LAMPs诱导人THP-1细胞产生炎症物质

发布时间：2017-05-12 13:20

  本文关键词：核因子Nrf2负向调节肺炎支原体LAMPs诱导人THP-1细胞产生炎症物质，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)的主要致炎因子。实验通过研究核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)对Mp LAMPs诱导人单核系THP-1细胞产生炎症因子、炎症蛋白及炎症介质的影响,了解Nrf2对Mp LAMPs所致炎症反应的调节作用,为进一步研究Mp的致病机制提供新的理论依据。[方法]培养Mp,离心收集菌体沉淀并抽提LAMPs,用BCA法测定LAMPs浓度。构建慢病毒载体p LKO.1-Nrf2 sh RNA,将其与辅助包装质粒(ps PAX2,p MD2G)共同转染HEK 293T细胞用以包装慢病毒,将收获的慢病毒感染体外培养的THP-1细胞,嘌呤霉素筛选阳性感染细胞后,western blot和q RT-PCR分别检测慢病毒感染后THP-1细胞Nrf2的蛋白和m RNA水平。用5μg/m L和10μg/m L Mp LAMPs分别刺激Nrf2 sh RNA慢病毒感染的THP-1细胞和对照慢病毒感染细胞,并设立PBS刺激为阴性对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用为阳性对照组。ELISA检测处理后各组THP-1细胞白细胞介素6(interleukine 6,IL-6)、白细胞介素8(interleukine 8,IL-8)与前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的表达,Griess法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生水平,western blot检测环氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,i NOS)的表达。7.5μg/m L Mp LAMPs分别刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase,HO-1)特异性激动剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin,Co PP)或HO-1特异性抑制剂锌原卟啉(zinc protoporphyrin,Zn PP)预处理的THP-1细胞,Nrf2 sh RNA慢病毒感染细胞,对照病毒慢感染细胞及PBS处理的THP-1细胞,运用荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测ROS的产生水平。[结果](1)测序结果显示所构建的p LKO.1-Nrf2 sh RNA慢病毒正确。与对照慢病毒感染及PBS处理的THP-1细胞相比,p LKO.1-Nrf2sh RNA慢病毒感染细胞Nrf2 m RNA表达水平分别抑制了64.73%与62.98%,而Nrf2的蛋白表达量分别抑制了44.43%与40.48%;Mp LAMPs处理后p LKO.1-Nrf2 sh RNA慢病毒感染细胞Nrf2 m RNA表达水平与蛋白表达量分别降低了66.12%与52.12%;(2)Mp LAMPs刺激显著增强了THP-1细胞中IL-6、IL-8、COX-2、i NOS、PGE2的表达水平与NO和ROS的产生水平。Mp LAMPs刺激Nrf2 sh RNA慢病毒感染的THP-1细胞后,IL-6、IL-8与PGE2的表达水平分别为150.09pg/m L,196.18pg/m L和123.88 pg/m L,较对照慢病毒感染的THP-1细胞分泌的IL-6、IL-8与PGE2(分别为75.03pg/m L,90.09pg/m L与66.42pg/m L)显著增高(p0.05);Mp LAMPs刺激后,Nrf2基因沉默组THP-1细胞表达的COX-2、i NOS蛋白水平较对照组分别升高了20.37%与26.65%(p0.05),Nrf2基因沉默组THP-1细胞产生的NO与ROS分别较对照组增加了73.17%与19.57(p0.05);(3)与无处理细胞相比较,ROS清除剂NAC预处理THP-1细胞后Mp LAMPs刺激细胞产生的ROS水平降低了8.28%,而Mp LAMPs诱导细胞HO-1 m RNA的表达水平升高了12.76倍;与无处理细胞相比较,HO-1特异性激动剂Co PP处理组Mp LAMPs刺激细胞产生的ROS水平降低了7.64%,而HO-1特异性抑制剂Zn PP处理组Mp LAMPs刺激细胞产生的ROS的水平升高了15.28%。[结论]Nrf2能够负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞表达IL-6、IL-8、COX-2、i NOS、PGE2与产生NO和ROS。
【关键词】：肺炎支原体 脂质相关膜蛋白 核因子E2相关因子2 炎症
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R375
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 绪论15-19
• 第2章 实验材料19-23
• 2.1 主要实验仪器19-20
• 2.2 支原体菌株20
• 2.3 细胞株20
• 2.4 质粒20
• 2.5 实验主要试剂20-21
• 2.6 主要抗体21
• 2.7 培养基及溶液配制21-22
• 2.8 其他22-23
• 第3章 实验方法23-41
• 3.1 细胞培养、传代、冻存与复苏23-24
• 3.2 pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒载体的构建、包装与感染24-29
• 3.3 Mp LAMPs的抽提，，内毒素及浓度测定29-32
• 3.4 ELISA检测IL-6、IL-8、PGE2的表达水平32-33
• 3.5 Griess法检测NO的产生33-34
• 3.6 Western Blot检测Nrf2、iNOS与COX2蛋白的表达34-36
• 3.7 Nrf2对Mp LAMPs诱导THP-1 细胞产生ROS影响的检测36-37
• 3.8 qRT-PCR检测Nrf2 mRNA与HO-1 mRNA的表达水平37-39
• 3.9 统计学分析39-41
• 第4章 实验结果41-56
• 4.1 构建pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒载体41
• 4.2 检测Nrf2 shRNA慢病毒感染对THP-1 细胞Nrf2的干扰效果41-43
• 4.3 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1 细胞表达IL-6、IL-843-45
• 4.4 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1 细胞表达COX-245-47
• 4.5 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1 细胞表达i NOS47-48
• 4.6 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1 细胞表达PGE248-50
• 4.7 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1 细胞产生NO50-51
• 4.8 Nrf2负向调节Mp LAMPs刺激THP-1 细胞产生ROS51-52
• 4.9 NAC与HO-1 抑制Mp LAMPs刺激THP-1 细胞产生ROS52-56
• 第5章 讨论56-60
• 第6章 结论60-62
• 参考文献62-68
• 综述68-80
• 参考文献75-80
• 攻读硕士学位期间主要研究成果80-81
• 资助本论文的科研项目81-82
• 致谢82

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 田培燕,邓祖国;胃肠道的细胞保护[J];黔南民族医专学报;1999年04期

2 王志均;消化道的细胞保护[J];北京医科大学学报;1990年02期

3 陈亚红,刘志洪,蔡汝秀,林智信;细胞内NAD(P)H水平分析技术的研究进展[J];化学进展;2004年06期

4 周建国;吕柏宁;孟刚;李坪恋;左茂盛;;热应激下热休克蛋白70对细胞保护作用研究进展[J];西南国防医药;2009年05期

5 ;胃肠道有哪些细胞保护作用?[J];中国临床医生;1999年11期

6 王志均;细胞保护:调节肽的生理功能之一?[J];生理科学进展;1986年04期

7 朱文玉;胃肠肽的细胞保护作用[J];胃肠病学;1998年03期

8 徐萌,张积仁,许少珍;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在细胞保护中的应用及其机制[J];中国生化药物杂志;2001年06期

9 范晓;徐杨;;前列腺素及胃细胞保护作用[J];中南药学;2006年06期

10 给娜,王玉芬;前列腺素的细胞保护作用研究进展[J];卫生职业教育;2005年19期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 尚喜雨;丁玉琴;刘萍;;谈胃的细胞保护作用[A];中南地区第六届生理学学术会议论文摘要汇编[C];2004年

2 郭一峰;周文丽;张建鹏;刘军华;冯伟华;焦炳华;;海螵蛸多糖对小鼠胃黏膜细胞保护作用的研究[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年

3 魏锡云;张锦;陈肃标;孙劲旅;;扶正中药对小鼠免疫细胞保护作用的形态定量分析[A];第五届全国生物医学体视学学术会议、第八届全军军事病理学学术会议、第四届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2002年

4 初亮;邵荟竹;王帅;周琴;刘克辛;姚继红;;槲皮素对HepG2细胞二相酶的诱导及细胞保护作用的研究[A];第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集[C];2009年

5 吴迪;闵伟;骆丹;;黄芩苷对UV损伤皮肤细胞保护作用的蛋白质组学研究[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年

6 谢建琼;方琴;王季石;胡秀英;崔欣;;人DNA修复基因MGMT导入NK细胞增强其抗药特性[A];贵州省2008年血液学年会论文汇编[C];2008年

7 范黎黎;尹蔚兰;唐小卿;;H2S对MPP~+损伤PC12细胞的拮抗作用及其机制[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

8 陈晓宇;席加喜;;血栓通对顺铂损伤HK-2细胞保护作用及其机制的研究[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

9 曹莉;尹鸿操;周礼;王拥军;;氧化型低密度脂蛋白致PC12细胞的毒性作用[A];全国第三届心脑血管疾病学术会议论文集[C];2003年

10 闵伟;骆丹;;黄芩苷对紫外线辐射损伤人表皮细胞保护作用的差异蛋白质组学研究[A];2009全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 本报记者 王丹;在围术期心脑保护领域书写历史[N];健康报;2012年

2 王建高;留学长才干报国正当时[N];科技日报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 郑晓磊;甲基牛扁亭对阿尔茨海默氏病细胞模型的作用及其相关分子机制的研究[D];山东大学;2015年

2 赵然尊;Nrf2对缺氧预处理内皮祖细胞成血管作用的影响及相关机制研究[D];第三军医大学;2015年

3 陈亚红;细胞内NAD水平分析及多酶氧化体系抑制效应的研究[D];武汉大学;2004年

4 陈雪梅;细胞应激适应中HSP90的作用和应激适应保护蛋白的初步筛选[D];第一军医大学;2004年

5 冯惠茹;～（32）Pβ射线持续低剂量率照射肿瘤细胞的放射生物学机制及端粒酶的治疗监控和放射增敏价值基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年

6 杨绍楠;丁内酯衍生物对阿尔茨海默氏病细胞模型的作用及其相关分子机制的研究[D];山东大学;2012年

7 宫智勇;热休克蛋白70在苯并（a）芘致细胞DNA损伤修复中的作用[D];华中科技大学;2006年

8 徐益苗;热休克蛋白27及其磷酸化对p53的调控及介导MCF-7细胞多柔比星耐受的研究[D];南京师范大学;2013年

9 李新毅;雌激素对Aβ所致PC12细胞损伤保护作用的研究[D];华中科技大学;2006年

10 何志松;GATA-4加强MSCs细胞对梗死后缺血心肌细胞保护作用及其机制探讨[D];苏州大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 马东东;SchB对UVA损伤HaCat细胞和鼠皮肤的保护作用的研究[D];河北联合大学;2014年

2 魏菀怡;IGF-1对肌萎缩侧索硬化细胞稳转模型的保护作用[D];河北医科大学;2015年

3 张明明;成纤维细胞生长因子9在肌萎缩侧索硬化症细胞模型中的保护作用及机制探讨[D];河北医科大学;2015年

4 涂立英;魔芋多糖及其降解产物生物活性的研究[D];集美大学;2015年

5 王宏心;急性脑梗死患者外周血Treg细胞及其相关炎性因子水平的观察分析[D];山东大学;2015年

6 冯英同;内质网应激介导紫檀芪抗食管癌细胞的机制研究[D];第四军医大学;2015年

7 其曼古丽·吐尔洪;蜂胶黄酮PB3A对人肿瘤细胞增殖抑制作用的研究[D];新疆大学;2015年

8 戴沛娟;Hsp90α抑制与HepG2细胞氧化还原状态变化及cyclinB1蓄积相关的G2/M期阻滞关系探讨[D];南方医科大学;2013年

9 欧广利;核因子Nrf2负向调节肺炎支原体LAMPs诱导人THP-1细胞产生炎症物质[D];南华大学;2015年

10 冯利杰;Tau蛋白介导的细胞毒性及泛素连接酶Hrd1的保护作用[D];安徽医科大学;2007年

  本文关键词：核因子Nrf2负向调节肺炎支原体LAMPs诱导人THP-1细胞产生炎症物质，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：359909