纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗制备及免疫保护机制初步研究

发布时间：2017-05-13 20:07

  本文关键词：纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗制备及免疫保护机制初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的:金黄色葡萄球菌是一种常见的可寄生于宿主的致病菌,同时也是引起全身脓毒血症等医院获得性感染的主要致病菌[1-3]。由于耐受抗生素的新菌株的出现,特别是MRSA的迅速蔓延,使得该病原菌的治疗变得越来越困难[2,4-6]。因此安全有效的金黄色葡萄球菌疫苗的研究已经迫在眉睫。疫苗在免疫防治重大感染性疾病中发挥着重要的作用,但是现有的免疫佐剂由于其成分及引起的免疫应答效应相对单一[7,8],极大的限制了疫苗免疫保护作用的充分发挥,因此研发安全、有效的新型免疫佐剂是未来疫苗研发的重要发展方向。本课题在综合分析传统免疫佐剂的优缺点、借鉴现代免疫佐剂的研发经验和发展趋势、在新型纳米乳佐剂研究工作的基础上[9-13],有机整合目前人用佐剂中的有效成分、合理优化佐剂组分的制剂配比,设计并制备具有自主知识产权的新型纳米乳佐剂,以金黄色葡萄球菌的全身感染模型为实验模型,在进行其处方优化、制剂工艺、质量标准等研究基础上,进一步从血清学水平、细胞学水平、动物整体水平对其激发的免疫应答谱学特征及作用机制进行系统研究,为新型有效的金黄色葡萄球菌基因工程疫苗的设计提供一定的实验基础与理论指导。研究方法:第一部分:纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗制备与表征鉴定(1)通过低能乳化法制备了三种载药方式的纳米乳佐剂疫苗,即包裹载药疫苗,混合载药疫苗,联合载药疫苗。(2)通过高速离心法以及粒度分析仪,透射电子显微镜,高分辨率电子扫描显微镜等充分检测并评价了纳米乳佐剂疫苗的形态学特征。第二部分:纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗的免疫学评价(1)疫苗免疫小鼠及免疫血清、脾细胞的收集:使用制备的三种载药方式的纳米乳佐剂疫苗与MF59佐剂疫苗,经6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行肌肉注射途径免疫,分别在第6天,第13天尾静脉取血,收集血清,无菌分装保存于-80℃备用。在小鼠末次免疫后第10天,实验组小鼠均摘眼球收集全血,收集血清,无菌分装保存于-80℃备用。同时,取血后的小鼠经手术分离脾脏并制备单细胞悬液,无菌分装保存于恒温细胞培养箱备用。(2)疫苗免疫后小鼠的血清学评价:ELISA法检测疫苗免疫后血清的特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a、Ig G2b抗体应答水平。(3)疫苗免疫后小鼠的细胞学评价:通过细胞增殖实验检测分离脾细胞的增殖能力;ELISPOT实验检测分离脾淋巴细胞中分泌IFN-γ,IL-4的细胞量;ELISA法检测分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激后表达含量变化;流式检测分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激后CD4+T细胞中记忆性T细胞含量。(4)疫苗免疫后小鼠的系统性评价:疫苗免疫后小鼠感染剂量攻毒后,对主要脏器的细菌定植量变化检测;疫苗免疫后小鼠感染剂量攻毒后,对肾脏切片并进行HE染色及病理分析;疫苗免疫后小鼠致死剂量攻毒后,对生存率以及疫苗保护率分析。(5)本论文所有实验数据用统计学软件SPSS20.0分析,采用非配对T检验分析数据的统计学差异。所有图示使用Graph Pad Prism 6.0软件制作。P值小于0.05代表有统计学显著差异,P值小于0.01代表有统计学极显著差异。第三部分:纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗免疫保护机制初步研究(1)经6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行肌肉注射途径免疫,在第8天取小鼠腋窝淋巴结研磨,离心后用调整细胞浓度为105 cells/100μL/孔,37℃,5%CO2条件下培养。检测腋窝淋巴节DC细胞表面中MHC分子与CD86分子含量变化。(2)培养小鼠原代骨髓来源DC细胞,激光共聚焦技术检测纳米乳佐剂疫苗被DC细胞吞噬效率。(3)通过活体成像技术检测纳米乳佐剂疫苗在皮下注射与肌肉注射两种给药方式下的缓释作用。研究结果:第一部分:纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗制备与表征鉴定结果通过高速离心的方法发现,三批纳米乳佐剂疫苗分别在6000rpm(5min)、6000rpm(15min)、12000rpm(5min)、12000rpm(15min)条件下均未发生分层以及破乳的现象。制备的3种不同载药方式的纳米乳佐剂疫苗平均粒径均在30nm左右,电位稳定均在-20 m V左右,多分散系数均小于0.2。通过透射电子显微镜分析,证明制备的纳米乳佐剂疫苗是稳定存在的纳米乳球形颗粒,而且分散性良好。通过高分辨率扫描电子显微镜分析,更加直观证明制备的纳米乳佐剂疫苗形态学特征是粒度均一,分散性良好的球形颗粒。第二部分:纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗的免疫学评价结果(1)疫苗免疫小鼠后的血清学评价结果:在免疫后一周内,MF59佐剂疫苗并不能迅速刺激机体产生Ig G抗体应答,但包裹载药疫苗能诱导高水平抗体应答且与MF59佐剂疫苗相比,具有统计学显著差异(P0.05);3种载药方式的纳米乳佐剂疫苗以及MF59佐剂疫苗均能够有效的提高Ig G1,Ig G2a、Ig G2b抗体应答水平。通过Ig G1水平分析,包裹载药疫苗组与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001);通过Ig G2a水平分析,佐剂疫苗组与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001),其中包裹载药疫苗组较其他佐剂组,Ig G2a抗体应答水平最高且具有统计学显著差异(P0.05)。通过Ig G2b水平分析,佐剂疫苗组与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.01)。由此提示:纳米乳佐剂疫苗的包裹载药方式是一种有高效免疫增强效果的疫苗制备形式。(2)疫苗免疫后小鼠的细胞学评价结果1)3种纳米乳佐剂疫苗以及MF59佐剂疫苗免疫小鼠后,取脾淋巴细胞进行抗原二次刺激后,脾淋巴细胞均出现了不同程度的增殖现象,且与未免疫过健康小鼠脾淋巴细胞对比,均具有统计学显著差异,其中包裹载药疫苗组(P0.01)、混合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组(P0.05)、联合载药疫苗组(P0.001)、MF59佐剂疫苗组(P0.05);由此得到提示:纳米乳佐剂疫苗能够有效的刺激机体产生记忆性细胞,在抗原二次刺激时,脾淋巴细胞能够迅速的增殖分化。2)包裹载药疫苗组与联合载药疫苗组与无佐剂HI疫苗组相比,激发分泌IFN-γ的脾淋巴细胞含量最为明显。其中包裹载药疫苗组激发分泌IFN-γ的脾淋巴细胞含量较无佐剂HI疫苗组,具有统计学极显著差异(P0.001),另外较MF59佐剂疫苗组也具有统计学显著差异(P0.05);包裹载药疫苗组激发分泌IL-4的脾淋巴细胞较无佐剂HI疫苗组,具有统计学极显著差异(P0.01),较MF59佐剂疫苗组也具有统计学显著差异(P0.05);由此提示:包裹载药疫苗组能够高效的刺激脾淋巴细胞分泌与细胞免疫相关的IFN-γ以及与体液免疫相关的IL-4。3)分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激3天后,3种不同载药方式的纳米乳佐剂疫苗以及MF59佐剂疫苗与无佐剂HI疫苗组相比均能激发分泌IFN-γ的产生,其中包裹载药疫苗组与MF59佐剂疫苗组所激发分泌IFN-γ与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001);经HI抗原刺激6天后,MF59佐剂疫苗组所激发分泌IFN-γ平均水平达到最高,与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.01)。由此提示:包裹载药疫苗组与MF59佐剂疫苗组能够高效刺激细胞产生IFN-γ,进而促进Th1细胞分化,达到增强疫苗细胞免疫的效果。4)分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激3天后,混合载药疫苗组与联合载药方式疫苗组所激发分泌IL-4水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.01);结果显示分离的脾淋巴细胞经HI抗原刺激6天后,联合载药疫苗组所激发分泌IL-4水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学显著差异(P0.05),MF59佐剂疫苗组IL-4表达含量并未发现明显的提高。由此提示:纳米乳佐剂疫苗能够有效的提高与IL-4正相关的体液免疫应答水平,其中联合载药方式的疫苗组效果较好,MF59佐剂对增强体液免疫应答水平不明显。5)分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激3天后,包裹载药疫苗组与MF59佐剂疫苗组所激发分泌IL-10水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学显著差异(P0.05),其中MF59佐剂疫苗组所激发分泌IL-10水平达到最高值;经HI抗原刺激6天后,包裹载药疫苗组所激发分泌IL-10水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001),MF59佐剂疫苗组IL-10表达含量明显的降低,同时包裹载药疫苗组IL-10表达含量明显的上升。由此提示:MF59佐剂疫苗组能够促进细胞分泌IL-10来刺激B细胞增殖并且抑制Th1细胞的生成,进而促进体液免疫应答,但是后期促进的效果并不明显。相反包裹载药疫苗组能够有效的提高IL-10分泌的含量,并与时间成正相关关系,进一步证明,包裹载药方式的疫苗是一种能够有效刺激产生体液免疫相关的疫苗形式。6)分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激3天后,包裹载药疫苗组与联合载药方疫苗组所激发分泌IL-12水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001),其中MF59佐剂疫苗组所激发分泌IL-12水平并未提高;结果显示分离的脾淋巴细胞经HI抗原刺激6天后,包裹载药疫苗组所激发分泌IL-12水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001),且较MF59佐剂疫苗组IL-12表达含量有统计学极显著差异(P0.01)。以上结果提示:包裹载药疫苗能够高效诱导细胞分泌产生IL-12,进而诱导Th1细胞分化,与检测的IFN-γ水平以及结论类似,进一步说明包裹载药疫苗能够诱导促进细胞免疫相关免疫应答。7)分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激3天后,包裹载药疫苗组与混合载药疫苗组所激发分泌IL-17水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.01);结果显示分离的脾淋巴细胞经HI抗原刺激6天后,3种不同载药方式的纳米乳佐剂疫苗以及MF59佐剂疫苗的所激发分泌IL-17水平与无佐剂HI疫苗组相比,具有统计学极显著差异(P0.001),且MF59佐剂疫苗组水平较高。以上结果提示:包裹载药方式疫苗组与MF59佐剂疫苗组均能够有效刺激产生IL-17,来促进机体中性粒细胞的生长与分化起到清除细菌的作用。8)分离脾淋巴细胞经HI抗原刺激3天后,包裹载药疫苗组所激发的CD4+T细胞中中心记忆性T细胞含量最高,并且较HI疫苗组有显著性差异(P0.001);MF59佐剂疫苗组所激发的CD4+T细胞中效应记忆性T细胞含量最高,较HI疫苗组有显著性差异(P0.001);分离的脾淋巴细胞经HI抗原刺激6天后,3种不同载药方式的纳米乳佐剂疫苗以及MF59佐剂疫苗的所激发的CD4+T细胞中中心记忆性T细胞以及效应记忆性T细胞较HI疫苗组含量均有所升高,并且有显著的统计学差(P0.05),其中联合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组所激发的CD4+T细胞中中心记忆性T细胞含量最高,并且较HI疫苗组有显著性差异(P0.01);MF59佐剂疫苗组所激发的CD4+T细胞中效应记忆性T细胞含量最高,较HI疫苗组有显著性差异(P0.05)。由此提示:纳米乳佐剂疫苗组的包裹载药方式更容易高效激发CD4+中心记忆性T细胞的产生,而MF59佐剂更易刺激机体产生CD4+效应记忆性T细胞。(3)疫苗免疫后小鼠的系统性评价结果1)通过与攻毒1天后的对应组别相比较,发现在全身感染3天后,血液以及脾脏的细菌定植量明显减少,细菌定植主要在肾脏,对比感染后1天与3天的结果,包裹载药疫苗组能够有效的提高机体产生细菌清除效果,从整体器官的水平验证了该种载药方式纳米乳佐剂疫苗是一种有开发潜力的疫苗来抵御金黄色葡萄球菌的感染。2)通过对肾脏切片病理损伤的综合评价,包裹载药疫苗组能够产生最轻的病理损伤效果,且与未免疫后攻毒的对照组小鼠相比,具有统计学极显著差异(P0.001)。由此提示:肾脏切片病理评分结果与细菌定植量检测结果相对应,再次验证包裹载药疫苗组有望成为金黄色葡萄球菌疫苗的潜在候选疫苗。3)3种不同载药方式的纳米乳佐剂疫苗以及MF59佐剂疫苗均能够产生有效的免疫保护作用,其中包裹载药方式与联合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组小鼠生存率为90%,混合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组小鼠生存率为80%,MF59佐剂疫苗组小鼠生存率为60%,HI疫苗组小鼠生存率为40%,His对照组小鼠生存率为20%。其中包裹载药方式与联合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组的生存率较His对照组有统计学极显著差异(P0.01);包裹载药方式与联合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组的疫苗保护率为87.50%,混合载药方式的纳米乳佐剂疫苗组的疫苗保护率为75.00%,MF59佐剂疫苗组的疫苗保护率为50.00%,HI疫苗组的疫苗保护率为25.00%。由此提示,纳米乳佐剂尤其是包裹载药方式更能提高动物生存率与疫苗保护率。第三部分:纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗免疫保护机制初步研究(1)包裹载药疫苗组免疫后小鼠淋巴节DC细胞表面中MHC I分子的表达最为显著,较HI疫苗组有显著的统计学差异(P0.001),联合载药方式疫苗组次之;其中包裹载药疫苗组免疫后小鼠淋巴节DC细胞表面中MHC II分子的表达量与HI疫苗组对比,存在显著的统计学差异(P0.001),混合载药方式疫苗组次之;其中混合载药方式的纳米乳佐剂疫苗免疫后小鼠淋巴节DC细胞表面中MHC II分子的表达量与HI疫苗组对比,存在显著的统计学差异(P0.001),包裹载药方式疫苗组次之。得到推论,包裹载药疫苗组能够起到良好的免疫保护效果,其一个重要原因为更易被DC细胞捕获,呈递,进而引发一系列的免疫级联反应。(2)激光共聚焦结果显示包裹载药疫苗组较混合载药方式的纳米乳佐剂疫苗以及HI佐剂疫苗均有更加明显的被DC细胞捕获的效果。从而进一步验证了推论,即包裹载药疫苗组存在“蛋白贮库”的作用,从而使更多抗原蛋白更易被DC细胞捕获,呈递,激发机体的免疫应答反应。(3)活体成像结果结果表明,包裹载药方式疫苗组在注射部位缓释的效果更好,因此能够不断的释放抗原被捕获,引起高效的体液免疫与细胞免疫应答。结论:1.包裹载药纳米乳佐剂疫苗、混合载药纳米乳佐剂疫苗、联合载药纳米乳佐剂疫苗能够显著提高体液免疫与细胞免疫应答水平,有效提高脏器细菌清除率与动物生存率,达到清除机体MRSA细菌目的,其中以包裹载药纳米乳佐剂疫苗最佳。2.免疫谱学特征差异性研究揭示,包裹载药纳米乳佐剂疫苗通过一种多通路的免疫应答网络机制起到良好免疫保护性效果。
【关键词】：纳米乳佐剂 金黄色葡萄球菌疫苗 血清学分析 细胞学分析 免疫机制
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-14
• 中文摘要14-20
• 第一章 前言20-22
• 第二章 纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗制备与表征鉴定22-31
• 2.1 引言22
• 2.2 材料与方法22-25
• 2.3 结果25-29
• 2.4 讨论29-31
• 第三章 纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗的免疫学评价31-57
• 3.1 引言31
• 3.2 材料与方法31-39
• 3.3 结果39-54
• 3.4 讨论54-57
• 第四章 纳米乳佐剂金黄色葡萄球菌疫苗免疫保护机制初步研究57-65
• 4.1 引言57
• 4.2 材料与方法57-60
• 4.3 结果60-64
• 4.4 讨论64-65
• 全文总结65-66
• 参考文献66-70
• 文献综述 人用疫苗佐剂应用及免疫学机制研究现状70-80
• 参考文献75-80
• 攻读硕士期间发表的论文以及参与的课题80-81
• 致谢81

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