金黄色葡萄球菌AgrC/AgrA双组份信号转导模型的构建与评价

发布时间：2022-12-07 01:01

　　金黄色葡萄球菌作为人类重要的致病菌,能引起多种感染。附属基因调节系统作为毒力因子的调控系统,在其致病过程中发挥着重要作用。该系统包含一个双组份信号转导系统（AgrC/AgrA）,AgrC负责感知外源信号刺激并将信号传递到胞内的AgrA,磷酸化后的AgrA可以特异性的与下游启动子P2P3之间的序列结合,并进而引起相关毒力因子的表达与释放。体外研究表明,AgrA异源表达过程中,往往在获得高水平表达的同时,容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体,不利于目的蛋白功能活性的研究。并且,膜蛋白AgrC在细胞膜上具有拓扑取向性,使得在体外研究双组份信号转导系统变得更加困难。因此,欲对金黄色葡萄球菌双组份信号转导系统的研究,首先需要解决AgrA可溶性表达的问题和AgrC在人工膜中的取向问题。该研究将为体外筛选和开发抗金黄色葡萄球菌感染的新药奠定一定基础。首先,采用无限制克隆法构建AgrA表达载体,在AgrA蛋白的C端融合绿色荧光蛋白（GFP）标签,通过实时监测GFP的荧光强度来快速检测重组蛋白的表达水平。利用单因素实验筛选出宿主菌株;然后,结合Box-Behnken试验设计,筛选出最优蛋白表达条件。其次,... 

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 金黄色葡萄球菌的耐药性
    1.2 细菌群体感应系统
        1.2.1 细菌群体感应系统简介
        1.2.2 金黄色葡萄球菌群体感应系统
        1.2.3 AgrC
        1.2.4 AgrA
        1.2.5 AIP信号分子
    1.3 人工细胞膜体系简介
        1.3.1 脂质体
        1.3.2 蛋白脂质体
    1.4 本研究工作的内容和意义
第二章 金黄色葡萄球菌反应调节蛋白AgrA的表达与纯化
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验菌株与质粒
        2.2.2 主要仪器与设备
        2.2.3 主要试剂与规格
        2.2.4 培养基与溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 表达载体的构建
        2.3.2 AgrA-GFP蛋白异源表达体系的优化
        2.3.3 GFP荧光测定
        2.3.4 AgrA-GFP与AgrA蛋白的纯化
        2.3.5 SDS-PAGE电泳与Western blot检测
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 重组表达载体pET-28a(+)-AgrA和pET-28a(+)-AgrA-GFP的构建
        2.4.2 表达菌株的筛选
        2.4.3 Box-Behnken 设计法优化蛋白表达条件
        2.4.4 AgrA-GFP和AgrA蛋白的表达与纯化
        2.4.5 讨论
第三章 受体蛋白AgrC跨膜镶嵌的人工细胞膜体系的构建及其评价
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验菌株
        3.2.2 主要仪器与设备
        3.2.3 主要试剂与规格
        3.2.4 培养基与溶液配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 蛋白的表达与纯化
        3.3.2 脂质体的制备
        3.3.3 脂质体的表征
        3.3.4 蛋白脂质体的制备
        3.3.5 AgrC蛋白脂质体中AgrC取向分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 最佳缓冲体系的筛选
        3.4.2 带负电磷脂比例和胆固醇含量对脂质体稳定性的影响
        3.4.3 最佳镶嵌比例的确定
        3.4.4 蛋白脂质体中AgrC取向分析
        3.4.5 讨论
第四章 AgrC/AgrA双组份信号转导模型的构建与EMSA评价
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 主要仪器与设备
        4.2.2 主要试剂与规格
    4.3 实验方法
        4.3.1 AgrA蛋白活性检测
        4.3.2 AgrC激酶活性的测定
        4.3.3 AgrC/AgrA双组份信号转导模型的构建
        4.3.4 启动子P2P3核心序列的复性
        4.3.5 AgrC/AgrA双组份信号转导模型的EMSA检测
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 AgrA蛋白活性的检测
        4.4.2 AgrC蛋白活性的验证
        4.4.3 复性后P2P3核心序列的检测
        4.4.4 AgrC/AgrA双组份信号转导模型的EMSA检测
        4.4.5 AgrC对EMSA实验的影响
        4.4.6 讨论
第五章 总结与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同电性脂质体对金黄色葡萄球菌组氨酸激酶AgrC跨膜镶嵌效率的影响[J]. 熊文,权春善,王丽娜,张旭宁,赵晶,郑维,范圣第.  高等学校化学学报. 2014(09)
[2]外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略[J]. 朱红裕,李强.  过程工程学报. 2006(01)
[3]EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达[J]. 朱希强,袁勤生.  食品与药品. 2005(04)
[4]胆固醇对细胞膜结构和功能的影响[J]. 毛应华,糜漫天.  国外医学(卫生学分册). 2004(06)
[5]植物伴生细菌数量应答系统的研究进展[J]. 宋水山,贾振华,高振贤,马宏,段普凡.  微生物学通报. 2004(02)
[6]GFP与微管结合蛋白和肌动蛋白结合区融合蛋白载体构建与表达[J]. 胡建广,尹艳.  中国生物工程杂志. 2004(01)
[7]胆固醇/磷脂比例的变化对Gs与AC偶联功能的影响[J]. 罗柏,杨小毅,黄有国.  生物物理学报. 1997(02)
[8]在大肠杆菌表达体系中以包涵体形式存在的真核生物蛋白质的分离、复性和二硫键的形成[J]. 陈来同,茹炳根.  中国生化药物杂志. 1997(01)

硕士论文
[1]脂质体Na+、K+Gibbs-Donnan平衡与振荡现象[D]. 晏芳.浙江工商大学 2008



本文编号：3711947