中国特有小型猪内源反转录病毒宿主范围及细胞嗜性研究

发布时间：2023-03-06 19:36

　　异种移植,是指将有活力的细胞、器官、组织进行种间移植,有望成为缓解同种移植中人源器官资源短缺的有效途径。出于器官大小、生理相容性和伦理道德方面的考虑,猪被认为是最合适的异种移植供体。然而,猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)可以由正常的猪源细胞释放,有关PERV体外感染人源细胞系和体内感染重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠有关组织的发现,引起人们对临床上异种移植病原安全性的担忧,即带有PERV的猪源细胞、组织、器官移植到病人体内,是否会引发人兽共患病的流行或导致癌症的发生?鉴于人免疫系统缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SRAS-CoV)等一系列动物源性病毒所带来的威胁,有关PERV在异种移植中的感染性和对PERV的病原安全性进行系统评价成为了这一领域研究的热点。 虽然在接受猪源细胞、组织和器官...

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【学位级别】：硕士

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英文摘要
前言
材料与方法
    1. 材料
    2.P ERV- WZSP- env基因的扩增与克隆
        2.1 PERV-WZSP-env序列分析
        2.2 PERV-WZSP-env基因引物设计与合成
        2.3 外周血单个核细胞的分离
        2.4 PBMC 总RNA的提取
        2.5 反转录合成cDNA第一链
        2.6 PCR扩增产物的克隆与鉴定
        2.7 pHCMV-env重组表达质粒的构建及鉴定
    3. 重组反转录病毒载体的构建
        3.1 MSCVneo-GFP的构建策略
        3.2 GFP基因引物设计与合成
        3.3 PCR扩增GFP片段
        3.4 目的片段的纯化、回收
        3.5 反转录病毒载体MSCVneo双酶切及GFP连接
        3.6 反转录病毒载体的鉴定
    4. 整合PERV囊膜的假型鼠白血病病毒的包装
        4.1 HEK293T细胞培养
        4.2 菌液扩大培养
        4.3 质粒DNA的中量提取及纯化
        4.4 假型反转录病毒的包装
        4.5 转染细胞基因组中env基因整合及转录情况的检测
        4.6 病毒浓缩
        4.7 假型病毒感染性的检测
        4.8 流式细胞仪测定假型反转录病毒的滴度
    5.P ERV细胞感染谱分析
        5.1 细胞培养
        5.2 细胞感染实验
        5.3 细胞感染谱分析
结果
    1. 五指山猪PERV-env核酸序列比对与进化分析结果
        1.1 五指山猪PERV-env核酸序列比对结果
        1.2 五指山猪PERV-Env氨基酸序列进化分析结果
    2.P ERV-env基因扩增、克隆及鉴定结果
        2.1 PERV-env基因的PCR扩增结果
        2.2 pGEM-T-env重组质粒的鉴定结果与初步分析
        2.3 pHCMV-env表达质粒的鉴定结果
    3.p MSCVneo-GFP的构建与鉴定结果
        3.1 GFP基因PCR扩增结果
        3.2 重组反转录病毒载体pMSCVneo-GFP的构建及鉴定
    4. 假型反转录病毒包装结果
        4.1 包装质粒转染HEK293T细胞结果
        4.2 转染细胞中env基因的整合及转录情况的检测结果
        4.3 假型病毒粒子的浓缩及鉴定
        4.4 假型病毒粒子感染性的检测
        4.5 假型反转录病毒滴度测定结果
    5. 细胞感染谱的获得及分析
        5.1 假型反转录病毒感染多种细胞结果
        5.2 PERV-WZSP感染谱分析
讨论
    1. 关于PERV的体外宿主范围细胞嗜性
    2. 关于PERV-WZSP-A囊膜化的假型鼠干细胞病毒包装
    3. 关于PERV-WZSP-A细胞感染谱
    4.P ERV-Env关键区域的比对结果
结论
参考文献
文献综述
    参考文献
附录
个人简历
致谢



本文编号：3757255