淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB和NspA表位肽的预测和实验筛选

发布时间：2017-05-21 09:20

  本文关键词：淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB和NspA表位肽的预测和实验筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的应用生物信息学软件分析预测淋病奈瑟菌外膜蛋白PⅠ和Nsp A的二级结构及其优势B细胞和T细胞表位肽,并进行人工合成。检测人工合成表位多肽与抗体的亲和能力以及刺激淋巴细胞增殖的程度,以筛选出抗原性较好的表位肽作为淋球菌候选表位肽,为后续淋球菌表位疫苗的研制提供了思路和理论依据。方法 1淋球菌外膜蛋白优势B细胞、T细胞表位肽的预测:选用本实验室先前实验研究中经测序确定的淋球菌标准株CMCC 29403的por B基因全长核苷酸序列,运用DNAStar软件将其核苷酸序列转化成为氨基酸序列,共348个氨基酸残基;Nsp A氨基酸序列则用Gene Bank中的WHO-A株,共174个氨基酸序列。应用在线工具TMHMM对Por B和Nsp A全长氨基酸序列进行跨膜区域的分析,利用EXPASY服务器上的GOR4和SOPMA工具预测Por B和Nsp A的二级结构,通过DNAStar软件Protean模块的Karplus-Schulz方法、Kyte-Doolittle方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析Por B和Nsp A蛋白的柔韧性、亲水性、表面可及性和抗原性,以综合预测其优势B细胞表位。选择常见的HLA基因型,并兼顾小鼠H2-Ed、Ek限制性,利用SYFPEITHI软件以多肽上氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分,选择得分高的肽段作为候选T细胞表位,Net MHC-II软件则以肽段分子与MHC分子的亲和力为判断依据,亲和力强则肽段的抗原性较高,综合SYFPEITHI和Net MHC-II两个软件的分析结果并确定T细胞抗原表位存在的可能区域,将预测出的表位多肽交由公司合成。2优势表位肽的实验筛选:采用甲醛处理法、乙醇处理法和加热法制备淋球菌全细胞抗原,经革兰染色后显微镜镜检,以确定最佳的全细胞抗原制备方法。选用最佳方法制备灭活的全细胞抗原,经无菌测试后,免疫BALB/c小鼠,收集小鼠脾脏淋巴细胞、淋巴结淋巴细胞和免疫血清。经淋巴细胞增殖实验测定多肽刺激淋巴细胞增殖的程度;通过ELISA法测定多肽对小鼠免疫血清的反应性,以初步评价多肽与特异性抗体的亲和能力。从而筛选出具有良好抗原性的优势表位肽。结果 1 Por B蛋白的N端1-20位氨基酸为跨膜区,20位以后的氨基酸则位于膜外;Nsp A蛋白的N端1-25位氨基酸为跨膜区,25位以后的氨基酸则位于膜内;Por B和Nsp A的二级结构以无规则卷曲为主,亦可见α螺旋和β折叠;综合其柔韧性、亲水性、表面可及性和抗原性特征显示Por B蛋白优势B细胞表位可能存在于氨基酸序列N端的168~178和127~133两个区段。Nsp A潜在优势B细胞抗原肽表位则位于第90~99和70~76肽段。SYFPEITHI和Net MHC-II两种软件预测出Por B的T细胞优势表位可能位于第212~226,229~243位氨基酸,Nsp A的T细胞表位存在于129~137,2~16氨基酸。2显微镜检查结果提示:乙醇处理法制备的淋球菌全细胞抗原质量最佳,其次为甲醛,加热处理的全细胞抗原数量少,菌体完整性有所破坏,随加热温度提高,淋球菌全细胞抗原质量越差。淋巴细胞增殖实验结果表明:Nsp A蛋白的B细胞表位91~99氨基酸序列、Por B蛋白B细胞表位168~178氨基酸序列能有效刺激全细胞抗原免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞增殖;Nsp A蛋白的T细胞表位130~137和2~16位氨基酸序列,Por B蛋白的T细胞表位212~226、229~243位氨基酸序列能有效刺激全细胞抗原免疫后的小鼠淋巴结细胞增殖。ELISA法检测表明Por B蛋白的B细胞表位168~178氨基酸序列、Nsp A蛋白B细胞表位91~99氨基酸序列与淋球菌全细胞抗原特异性血清亲和能力较强,其中Por B蛋白的B细胞表位168~178氨基酸序列与淋球菌全细胞抗原特异性血清亲和能力强于Nsp A蛋白B细胞表位91~99氨基酸序列。结论通过生物信息学技术预测出了淋球菌外膜蛋白Por B和Nsp A的T细胞和B细胞可能的抗原表位。通过淋球菌全细胞抗原免疫小鼠后,收集淋巴结和脾脏淋巴细胞以及免疫血清,通过淋巴细胞增殖和ELISA法可检测和筛选经生物信息学预测出的多肽表位的抗原性。本研究结果表明:Nsp A蛋白中130~137和2~16氨基酸序列,Por B蛋白中229~243、212~226氨基酸序列可作为淋球菌疫苗研制中的优势T细胞表位,Nsp A蛋白中91~99氨基酸序列、Por B蛋白中168~178氨基酸序列,可作为淋球菌疫苗研制中的优势B细胞表位。本研究结果为后续淋球菌表位疫苗的研制提供了思路和理论依据。
【关键词】：淋病奈瑟菌 外膜蛋白 生物信息学 表位肽预测 表位肽筛选
【学位授予单位】：大理学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-15
• 实验材料15-18
• 技术路线18-19
• 第一部分淋球菌外膜蛋白Por B和Nsp A表位肽的预测19-29
• 1 引言19
• 2 方法19-21
• 3 结果21-27
• 4 讨论27-29
• 第二部分Por B和Nsp A蛋白优势抗原表位肽的筛选29-42
• 1 引言29
• 2 方法29-35
• 3 结果35-39
• 4 讨论39-42
• 全文总结42-43
• 参考文献43-49
• 附录49-50
• 文献综述50-57
• 参考文献54-57
• 致谢57

【参考文献】

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本文编号：383258