LOC401296分子相互作用蛋白的筛选和鉴定

发布时间：2017-06-13 20:06

  本文关键词：LOC401296分子相互作用蛋白的筛选和鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的采用酵母双杂交系统,寻找与LOC401296存在相互作用的蛋白,通过对相互作用蛋白的分析,以进一步了解LOC401296的功能。方法1采用酵母双杂交的方法筛选LOC401296的相互作用蛋白。首先构建p DBLeu-loc融合表达载体,再将p DBLeu-loc转入Ma V203酵母菌株,并进行毒性和自激活检测;然后筛选成人肝c DNA文库,进行阳性克隆三报告基因表型鉴定;最后阳性克隆回转验证,排除假阳性克隆。生物信息学分析筛选到的阳性克隆。2采用细胞免疫荧光方法联合激光共聚焦技术观察LOC401296与相互作用蛋白在HEK293细胞中的共定位。结果1通过酵母双杂交技术筛选出了LOC401296相互作用蛋白。成功构建p DBLeu-loc融合表达载体,并对筛选到的阳性克隆回转验证。将得到的阳性基因进行生物信息学分析共得到8个阳性克隆。2成功构建p EGFP-GRN、p EGFPPLSCR1、p EGFP-N4BP2L2三个融合表达载体。采用细胞免疫荧光方法联合激光共聚焦技术观察LOC401296分别与GRN、PLSCR1、N4BP2L2在HEK293细胞中共定位情况,发现LOC401296与3个相互作用蛋白均存在共定位。结论1通过酵母双杂交技术筛选LOC401296的相互作用蛋白,共筛选出8个阳性克隆,分别为GRN、PLSCR1、N4BP2L2、FN1、NOTCH3、LTBP3、ADAMTS-L4、EGFL7,这些基因各具功能,这表明了LOC401296参与的生物学过程的多样性及其作用机制的复杂性。2通过细胞免疫荧光方法联合激光共聚焦技术对LOC401296和GRN、PLSCR1、N4BP2L2进行了细胞内定位研究,观察到LOC401296与GRN、PLSCR1、N4BP2L2在HEK293细胞内的表达以及良好的共定位情况,为后续研究LOC401296的功能提供了线索。
【关键词】：LOC401296 酵母双杂交技术 相互作用蛋白
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51;R3411
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 英文缩略表9-10
• 引言10-12
• 第1章 酵母双杂交技术筛选相互作用蛋白12-31
• 1.1 实验材料12-17
• 1.1.1 菌株、细胞、载体12-14
• 1.1.2 主要酶制剂、试剂盒、试剂14-15
• 1.1.3 主要仪器设备15
• 1.1.4 主要培养基和缓冲液的配制15-17
• 1.2 实验方法17-23
• 1.2.1 PDBLeu-LOC诱饵载体的构建17-18
• 1.2.2 PDBLeu-LOC诱饵质粒转化酵母及毒性、自激活检测18-20
• 1.2.3 pDBLeu-loc作为诱饵筛选成人肝cDNA文库20-23
• 1.2.4 阳性酵母菌落的鉴定23
• 1.2.5 回转验证23
• 1.3 结果23-30
• 1.3.1 诱饵载体pDBLeu-loc构建23-24
• 1.3.2 诱饵质粒pDBLeu-loc在MaV203酵母菌株中毒性及自激活检测24-25
• 1.3.3 以pDBLeu-loc为诱饵筛选成人肝cDNA文库25-27
• 1.3.4 阳性克隆质粒回转验证27-28
• 1.3.5 阳性克隆猎物质粒测序与分析28-29
• 1.3.6 阳性克隆文库质粒序列编码蛋白质的生物信息学分析29-30
• 1.4 小结30-31
• 第2章 LOC401296及相互作用蛋白的共定位31-52
• 2.1 实验材料31-35
• 2.1.1 菌株、细胞、载体31
• 2.1.2 主要酶制剂、试剂盒、试剂31-32
• 2.1.3 主要仪器设备32-33
• 2.1.4 主要培养基和缓冲液的配制33-35
• 2.2 实验方法35-40
• 2.2.1 pEGFP-GRN、pEGFP-PLSCR1、pEGFP-N4BP2L2载体的构建35-37
• 2.2.2 GRN、PLSCR1、N4BP2L2的pEGFP融合质粒在HEK293细胞中表达37-39
• 2.2.3 细胞免疫荧光和激光共聚焦技术观察三个蛋白与LOC401296共定位39-40
• 2.3 结果40-50
• 2.3.1 pEGFP-GRN、pEGFP -PLSCR1、pEGFP -N4BP2L2载体的构建40-44
• 2.3.2 Western Blot检测pEGFP-GRN、pEGFP-PLSCR1、pEGFP-N4BP2L2在HEK293细胞中蛋白表达44
• 2.3.3 细胞免疫荧光和激光共聚焦技术观察三个蛋白与LOC401296的定位44-50
• 2.4 小结50-52
• 第3章 讨论52-56
• 3.1 ProquestTM Two-Hybrid System的优势52-53
• 3.2 颗粒蛋白（GRN）53
• 3.3 磷脂爬行酶 1（PLSCR1）53
• 3.4 Notch353-54
• 3.5 表皮生长因子样结构域 7（EGFL7）54
• 3.6 纤维粘连蛋白-1（FN1）54
• 3.7 隐性TGF-β 结合蛋白-3（LTBP3）54-55
• 3.8 ADAMTS-L455
• 3.9 N4BP2L255-56
• 3.10 LOC401296蛋白质相互作用网络的构建56
• 参考文献56-61
• 第4章 综述61-72
• 4.1 相互作用蛋白组学在系统生物学中的地位61-62
• 4.1.1 蛋白质相互作用的核心作用61-62
• 4.2 筛选相互作用蛋白的方法62-64
• 4.2.1 酵母双杂交技术62-63
• 4.2.2 亲和纯化偶联质谱法63-64
• 4.2.3 酵母双杂交和亲和纯化偶联质谱法的比较64
• 4.3 体内的相互作用-酵母双杂交技术64-69
• 4.3.1 酵母双杂交技术的原理64-66
• 4.3.2 现有酵母双杂交系统及其优势66-68
• 4.3.3 酵母双杂交系统的局限性68-69
• 4.4 小结69
• 参考文献69-72
• 结论72-73
• 致谢73-74
• 导师简介74-75
• 作者简介75-76
• 学位论文数据集76

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  本文关键词：LOC401296分子相互作用蛋白的筛选和鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

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