SIRT1的选择性剪接变异体参与大鼠神经干细胞的分化研究

发布时间：2017-06-17 06:08

  本文关键词：SIRT1的选择性剪接变异体参与大鼠神经干细胞的分化研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:神经干细胞是分布于神经系统的、具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,能生成多种神经细胞。由于其免疫原性低又具有良好的迁移性能,被广泛用于神经损伤后再生与修复领域。神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,但其分化受到多种因素影响,包括细胞外环境、营养素、细胞因子、信号通路和转录因子等。而在神经损伤以及神经退行性疾病的局部微环境中,神经干细胞往往分化为神经胶质细胞,如何控制神经干细胞在特定环境下分化为预期的终末细胞是待解决的关键问题。沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一种NAD+依赖的脱乙酰基酶,通过对组蛋白及多种非组蛋白进行去乙酰化修饰参与细胞衰老、细胞分化、细胞凋亡、细胞糖脂代谢等重要的生理过程。已有研究发现SIRT1在神经干细胞的分化过程中发挥一定的调控作用,但有关其调控方向的研究结果不一致。例如,研究显示诱导神经干细胞分化后SIRT1水平显著下降,过表达SIRT1使神经干细胞向神经元的分化减少;但也有研究指出抑制SIRT1使神经干细胞的分化能力显著提高。因此,有关SIRT1与神经干细胞分化过程的研究现状是,SIRT1具有调控神经干细胞分化的作用,但究竟是神经干细胞分化的促进因子还是抑制因子,目前尚没有统一结论。选择性剪接(Alternative Splicing,AS)是指m RNA前体(Pre-m RNA)通过选择不同剪接位点的组合,剪切掉不同的内含子或外显子,将同一基因中的外显子以不同的组合方式产生不同的成熟m RNA分子。不同的m RNA选择性剪接异构体可以进一步翻译成功能不同或互相拮抗的蛋白质,或者在相同的细胞由于表达水平的不同导致不同的表型。不同的选择性剪接变异体在具体的细胞功能活动中可能是相互独立或共同发挥作用。近年研究显示SIRT1存在选择性剪接,如人的SIRT1已经发现两种选择性剪接变异体,分别是缺失第8外显子的SIRT1-△Exon8和缺失第2至第9外显子的SIRT1-△Exon2/9,这两种不同的选择性剪接变异体各自发挥特定的功能,明显区别于SIRT1-FL在细胞中发挥的功能。已知SIRT1广泛分布于大鼠神经系统,而SIRT1的选择性剪接变异体是否也存在于此尚不清楚;如果存在,其选择性剪接变异体的功能是什么以及它是否参与了神经干细胞的分化呢。我们推测大鼠神经系统可能存在SIRT1的选择性剪接变异体,也许正是之前忽略了SIRT1选择性剪接的存在,才导致了SIRT1在神经干细胞分化中矛盾结论的产生,即SIRT1选择性剪接的存在可能为之前有关SIRT1作用的矛盾观点提供一个合理的解释。目前有关SIRT1选择性剪接的研究多数集中在小鼠和人源细胞。大鼠是仅次于小鼠的最常用的实验哺乳动物,已知SIRT1广泛分布于大鼠神经系统,探讨大鼠SIRT1是否存在选择性剪接将为后续研究选择性剪接变异体的生理、病理功能奠定基础。SIRT1基因在哺乳动物高度保守,而由于种属差异,大鼠的SIRT1基因与人类并不完全相同。通过基因比对,我们推测大鼠的SIRT1基因很有可能缺失第7外显子,即产生SIRT1-△Exon7。因此,本研究首先观察大鼠神经系统是否存在SIRT1-△Exon7,其次比较SIRT1的全长(SIRT1-FL)和SIRT1的选择性剪接变异体(SIRT1-△Exon7)在海马(神经干细胞的来源部位)和皮层(成熟神经细胞的富集部位)这两个部位的表达差异,为SIRT1-△Exon7是否参与神经干细胞的分化提供初步的探索;再通过比较SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神经干细胞分化前后的表达变化和酶活性差异,进一步明确SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神经干细胞分化过程中的作用。方法:1、PCR检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7:取新生SD大鼠的大脑组织,分离海马与皮层。提取总RNA,普通反转录PCR检测SIRT1-FL和选择性剪接变异体SIRT1-△Exon7的表达。然后再应用RT-PCR方法分别检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在海马与皮层这两个部位的表达。2、神经干细胞培养、鉴定及诱导分化:采用无血清细胞培养法,新生大鼠海马神经干细胞增殖形成悬浮的神经球后,应用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定,检测其标记性蛋白巢蛋白(Nestin)的表达。再用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基诱导神经干细胞分化,随后分别用神经元特异性的微管相关蛋白β-Tubulin抗体和神经胶质细胞特异性的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体行免疫荧光染色,鉴定已经分化的神经元和胶质细胞。3、RT-PCR检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7:应用RT-PCR方法,检测增殖的神经球和神经球诱导分化后SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7的m RNA含量。4、SIRT1酶活性检测:用SIRT1活性检测试剂盒检测神经球分化前后SIRT1去乙酰化酶活性的变化。结果:1、SIRT1-△Exon7和SIRT1-FL的m RNA在大鼠海马和皮层均有表达;2、海马SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低62.02%(P0.05),皮层SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低83.33%(P0.05);皮层SIRT1-FL m RNA含量比海马高5.81%(P0.05),而皮层SIRT1-△Exon7的含量比海马低56.68%(P0.05);3、神经干细胞分化前的SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低44.12%(P0.05),分化后SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低74.62%(P0.05);神经干细胞分化后的SIRT1-FL m RNA含量较分化前增高30.21%,SIRT1-△Exon7的m RNA含量较分化前降低41.02%(P0.05);分化后总的SIRT1去乙酰化酶活性较分化前增高30.08%(P0.05)。结论:1、我们首次发现大鼠神经系统存在SIRT1-△Exon7;2、SIRT1-△Exon7在海马和皮层的表达水平都低于SIRT1-FL,皮层的SIRT1-△Exon7水平低于海马,而皮层的SIRT1-FL水平高于海马,间接提示SIRT1-FL可能促进了神经干细胞的分化过程而SIRT1-△Exon7可能发挥相反的作用;3、SIRT1-△Exon7在神经干细胞分化前后的表达水平都低于SIRT1-FL,分化后的SIRT1-△Exon7水平低于分化前,分化后的SIRT1-FL水平高于分化前,这一结果与海马和皮层的实验结果相一致,进一步明确SIRT1-FL可能促进神经干细胞分化而SIRT1-△Exon7抑制分化。神经干细胞分化后较分化前相比,总的SIRT1去乙酰化酶活性升高水平(30.08%)与SIRT1-FL的m RNA含量的升高水平(30.21%)几乎一致,提示SIRT1-FL可能是通过增高其去乙酰化酶活性而促进神经干细胞的分化;而SIRT1-△Exon7在分化后不但水平下降,且由于其缺失第七外显子而使酶活性也大大降低,因此SIRT1-△Exon7几乎不可能对总的SIRT1酶活性的升高做出贡献,提示SIRT1-△Exon7可能作为独立于SIRT1-FL之外的一个信号分子抑制神经干细胞的分化。
【关键词】：神经干细胞 分化 选择性剪接 SIRT1 SIRT1-△Exon7
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338
【目录】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 常用缩写词中英文对照表13-14
• 前言14-17
• 1 材料与方法17-28
• 1.1 主要仪器和试剂17-19
• 1.2 主要培养基、溶液的配制方法19-20
• 1.3 实验分组20
• 1.4 实验方法20-27
• 1.5 统计学处理27-28
• 2 结果28-37
• 2.1 检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7 的mRNA在大鼠海马及皮层的表达28-31
• 2.2 比较SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7 的mRNA在神经干细胞分化前后的表达差异31-37
• 3 讨论37-40
• 4 结论40-41
• 参考文献41-44
• 综述44-50
• 参考文献48-50
• 致谢50-51
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果51-52
• 个人简历52

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张敬军,夏作理,刘焯霖;神经干细胞的研究[J];泰山医学院学报;2002年02期

2 季庆;神经干细胞的研究近况[J];医学综述;2002年05期

3 刘岳文,杜永红,王可,徐正顺;神经干细胞的研究进展[J];河南科技大学学报(医学版);2003年02期

4 刘佳梅,陈东,孟晓婷;一种获得神经干细胞单细胞的新方法[J];中国康复理论与实践;2004年01期

5 王忠诚,于春江;神经干细胞研究进展[J];心脑血管病防治;2004年03期

6 杨东波,李永利,蒋传路,杨立庄;神经干细胞分化调控机制研究进展[J];中华神经外科疾病研究杂志;2004年05期

7 薛杉;张旺明;徐如祥;;神经干细胞的迁移和网络化(英文)[J];中国临床康复;2005年45期

8 张丽;顾振伦;秦正红;;神经干细胞分化为神经元的基因调控(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2006年05期

9 刘佳梅;;脑内皮细胞与神经干细胞共培养促进神经干细胞的迁移[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2009年04期

10 张立波;邢华;许宽华;郭联庆;恽时锋;;神经干细胞的研究及前景分析[J];中国比较医学杂志;2010年10期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王华;王文辉;林蕾;;神经干细胞的研究进展及前景展望[A];第六届西部介入放射学术会议宁夏医学会放射学分会第四届年会介入放射学新技术继续教育学习班论文汇编[C];2009年

2 戴毅;韩忠朝;;神经干细胞研究进展及临床前景展望[A];中国解剖学会第八届组织学与胚胎学专业青年研讨会论文集[C];2004年

3 孙一睿;胡锦;王尔松;奚才华;姚海军;;单层黏附培养技术在哺乳动物神经干细胞体外稳定增殖和多向分化中的应用[A];中国医师协会神经外科医师分会第四届全国代表大会论文汇编[C];2009年

4 刘佳梅;;脑内皮细胞与神经干细胞共培养促进神经干细胞的迁移[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

5 魏勇;应大君;张伟;董世武;;幼龄家猪脑SVZ神经干细胞的分离与鉴定[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

6 司银楚;朱培纯;程龙;吴海霞;许红;;去皮层血管对成年大鼠脑内神经干细胞的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

7 李学坤;郭安臣;左萍萍;;胎鼠海马神经干细胞的培养、鉴定及亚克隆[A];中国药理学会第十届全国神经学术会议暨浙江省药理学会2002年年会论文摘要集[C];2002年

8 李力;万琪;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

9 李力;万琪;刘永红;张巍;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年

10 徐群渊;;神经干细胞的分离、纯化和永生化[A];中国组织工程、干细胞与神经再生学术会议论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 胡德荣;“抑制蛋白”可控制神经干细胞提前分化[N];健康报;2007年

2 孙国根　白毅;灵长类脑内神经干细胞被发现[N];中国医药报;2011年

3 孙国根;阻碍卒中后神经干细胞再生的“元凶”被发现[N];中国医药报;2013年

4 ;我国科学家成功地在体外培养出神经干细胞[N];中国高新技术产业导报;2001年

5 沈丽 付钰;神奇的神经干细胞[N];科技日报;2002年

6 时仲省 高思敏 刘春阳;河南医大成功培养人胚神经干细胞[N];中国医药报;2001年

7 梓华;神经干细胞可治恶性脑癌[N];医药经济报;2002年

8 许琦敏;脑损伤修复治疗又有新希望[N];文汇报;2007年

9 北京市神经外科研究所 北京天坛医院 王忠诚邋院士;神经修复的生力军——神经干细胞[N];健康报;2008年

10 孙国根;神经干细胞并非“全能制造者”[N];中国医药报;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张帆;Miranda磷酸化调控果蝇神经干细胞不对称分裂的机制[D];浙江大学;2014年

2 张坤;极化巨噬细胞与脊髓来源神经干细胞联合移植对脊髓损伤治疗作用的研究[D];第四军医大学;2015年

3 褚天慈;血管生成素2对胎鼠脑皮层神经干细胞诱导分化作用及其分子机制的研究[D];天津医科大学;2015年

4 胡园园;AF1q在神经发育中的功能及调控机制研究[D];山东大学;2015年

5 张凤云;神经干细胞中PFK-1对神经发生的负调控作用[D];南京医科大学;2016年

6 郭立云;猕猴胚胎源性神经干细胞诱导、脑内移植及其在青光眼玻璃体内的转归—探索性研究[D];昆明医科大学;2013年

7 任永娟;材料调控神经干细胞的研究[D];清华大学;2009年

8 曹翠丽;大鼠神经干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化[D];河北医科大学;2005年

9 周虎田;骨髓源神经干细胞生物学特性的研究[D];第一军医大学;2005年

10 段发亮;神经干细胞培养、增殖、迁移和分化的研究[D];第一军医大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 魏维;松果菊苷对神经干细胞体外增殖的影响[D];福建中医药大学;2015年

2 周强意;转TrkC神经干细胞联合胶原支架对创伤性脑损伤大鼠模型治疗作用的实验研究[D];北京协和医学院;2015年

3 孙爽;孕酮对Aβ_(25-35)损伤的神经干细胞增殖和分化的影响及机制研究[D];河北医科大学;2015年

4 田士来;RA与WNT信号通路联合调节神经元前体细胞分化的体外研究[D];第四军医大学;2015年

5 刘吉星;创伤性脑损伤后移植神经干细胞的研究[D];兰州大学;2016年

6 陈四化;叶酸联合神经干细胞治疗小鼠局灶性脑缺血损伤[D];兰州大学;2016年

7 李海太;BMP-4对大鼠骨髓间充质干细胞与神经干细胞共培养转归影响的实验研究[D];安徽医科大学;2016年

8 王红格;RAE-1分子在中枢神经系统中表达的研究[D];吉林大学;2016年

9 卫美辰;SIRT1的选择性剪接变异体参与大鼠神经干细胞的分化研究[D];山西医科大学;2015年

10 张贤;弓形虫棒状体蛋白ROP18对神经干细胞凋亡与分化的影响及机制研究[D];安徽医科大学;2016年

  本文关键词：SIRT1的选择性剪接变异体参与大鼠神经干细胞的分化研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：457557