ATP7A调控小鼠神经元形态发育的机理研究

发布时间：2017-06-23 23:09

  本文关键词：ATP7A调控小鼠神经元形态发育的机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜是哺乳动物体内必不可少的微量元素之一,具有氧化还原化学性质,对机体的代谢过程有重要的作用。同时,铜作为含铜酶和含铜蛋白质的重要组成部分,参与哺乳动物体内细胞呼吸、自由基清除、色素形成、结缔组织形成、神经肽加工和铁运输等。ATP7A是调节铜稳态的关键蛋白,还参与把铜传递给含铜酶和含铜蛋白,其基因突变导致的疾病,如门克斯病(MD),可以有效证明其作用的重要性。ATP7A功能的障碍往往伴随着神经退行,目前研究显示ATP7A受神经系统发育的时空调控,可能参与神经元的发育。为了研究ATP7A在神经元发育中的调控作用,本试验以C57BL/6小鼠为研究对象,分析了体外培养的小鼠神经干细胞(NSC)、星形胶质细胞和海马神经元中ATP7A的表达水平。并且利用多功能诱导干细胞——小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)向神经元定向分化的方法,研究了MEF敲除Atp7a后向神经元分化的细胞形态学差异,结果如下:1.从C57BL/6小鼠胚胎和新生乳鼠中分别分离出了神经干细胞(NSC)、星形胶质细胞和海马神经元,并通过细胞免疫荧光染色对其进行鉴定,其纯度均达到90%以上。2.分离了E13.5-14.5小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),通过细胞免疫荧光染色分析了MEF和以上三种细胞中ATP7A的细胞定位,显示荧光信号均位于细胞核和质膜之间。3.通过real-time QPCR和Western blot比较了这四种细胞中ATP7A的mRNA及其表达水平,发现ATP7A在MEF、NSC、星形胶质细胞和海马神经元中表达量依次是显著减少的,说明ATP7A的表达随神经发育过程可能下降,并且证明利用MEF向神经元转分化研究ATP7A调控神经元发育的方案是可行的。4.利用分离到的基因型为Atp7afl/Y的胚胎成纤维细胞(MEF7a+),通过感染Cre重组腺病毒敲除Atp7a,获得MEF7a+·Cre+/-,并用real-time QPCR和Western blot验证了其敲除效率约70%。5.进行重组腺病毒Ascl1,Brn2和Ngn2(ABN)诱导MEF7a+和MEF7a+·Cre+/-(ABN+MEF7a+和ABN+MEF7a+·Cre+/-),以及重组腺病毒Cre和ABN共同处理MEF7a+(ABNC+MEF7a+),向神经元的定向分化试验。分化7d和12d后,进行β-Tubulin III免疫荧光染色,对分化出的神经元进行形态上的分析和统计分析,计算胞体面积、神经纤维总长、最长神经纤维长度、从胞体发出的纤维数量、神经纤维分支数量。分化7 d后,实验组与对照组细胞形态无明显差别,阳性细胞胞体呈圆形、椭圆形和三角形,大多从胞体伸出细长突起。统计分析发现分化7 d时,ABN+MEF7a+·Cre+/-胞体体积较其他两组较小(*p0.05),与对照组相比,其他两组中,细胞从胞体发出较少且较短的神经纤维(***p0.001,**p0.01),也具有较少分支(***p0.001);分化12 d时,ABN+MEF7a+·Cre+/-和ABNC+MEF7a+胞体体积无差别,其他与分化7 d时相似。综上所述,本试验从体外细胞水平证明ATP7A影响体外神经元神经纤维的发育,敲除Atp7a后,细胞突起少且短,分支也较少。本试验为研究ATP7A调节神经元发育的作用提供了重要依据,为研究ATP7A突变引起的神经退行性疾病的机理提供了一定的基础。
【关键词】：神经元分化 ATP7A 转分化 原代培养
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 缩略语表11-12
• 1 文献综述12-20
• 1.1 铜的营养概述12-13
• 1.2 铜的体内平衡13-14
• 1.3 铜的细胞内平衡14
• 1.4 铜转运P型ATPases——ATP7A/ATP7B14-15
• 1.5 铜与神经退行性疾病15-16
• 1.6 ATP7A与神经系统发育16-20
• 2 引言20-21
• 3 材料与方法21-34
• 3.1 材料21-23
• 3.1.1 实验动物21
• 3.1.2 试剂21-22
• 3.1.3 主要仪器与耗材22-23
• 3.2 试剂的配置23
• 3.3 实验方法23-34
• 3.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养23-24
• 3.3.2 原代神经元的培养24
• 3.3.3 星形胶质细胞的培养24-25
• 3.3.4 神经干细胞的培养25
• 3.3.5 Ascl1/Brn2/Ngn2/Cre腺病毒的获得25-26
• 3.3.6 病毒滴度的测定26
• 3.3.7 Atp7afl/Y小鼠胚胎成纤维细胞Atp7a的敲除26-27
• 3.3.8 小鼠胚胎成纤维细胞转分化为神经元27-28
• 3.3.9 细胞的免疫荧光染色28
• 3.3.10 胚胎和新生小鼠基因型的鉴定28-29
• 3.3.11 Atp7a mRNA在细胞中的表达29-31
• 3.3.12 蛋白质免疫印迹31-33
• 3.3.13 作图与分析软件33-34
• 4 结果与分析34-49
• 4.1 原代细胞的分离与鉴定34-38
• 4.1.1 MEF的分离34-35
• 4.1.2 NSC的分离鉴定35-36
• 4.1.3 神经元的分离与鉴定36-37
• 4.1.4 星形胶质细胞的分离与鉴定37-38
• 4.2 四种细胞ATP7A的定位及表达量的分析38-40
• 4.2.1 ATP7A在四种细胞中的定位38-39
• 4.2.2 ATP7A在四种细胞中的表达39-40
• 4.3 病毒滴度的测定40-41
• 4.4 MEF7a+?Cre+细胞的获得41-43
• 4.4.1 MEF7a+细胞的获得41
• 4.4.2 MEF7a+细胞中Atp7a的敲除41-43
• 4.5 MEF7a+和MEF7a+?Cre+转分化差异43-49
• 4.5.1 三种处理中神经元胞体的体积的比较44-45
• 4.5.2 三种处理中从神经元胞体发出的神经突起数目比较45-46
• 4.5.3 三种处理中神经元神经纤维分支数目比较46-47
• 4.5.4 三种处理中神经元总神经纤维长度比较47-49
• 5 讨论49-53
• 5.1 原代细胞的分离49-50
• 5.2 ATP7A在神经干细胞的分化前后表达量下降50
• 5.3 ATP7A位于MEF和神经细胞的细胞核和质膜之间50
• 5.4 MEF向神经元转分化的方法50
• 5.5 转分化中涉及的转录因子和添加剂50-51
• 5.6 ATP7A不影响神经发生的过程和胞体的大小51-52
• 5.7 ATP7A影响神经元神经纤维的发育52
• 5.8 本试验的不足之处和展望52-53
• 6 结论53-54
• 参考文献54-61
• 致谢61-62
• 作者简介62
• 硕士期间发表的论文62

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本文编号：476538