GPI锚固蛋白CD59通过LAT介导T细胞信号转导的作用机制研究

发布时间：2017-06-28 18:05

  本文关键词：GPI锚固蛋白CD59通过LAT介导T细胞信号转导的作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨在T系急性白血病的Jurkat细胞中,GPI锚固蛋白CD59通过接头分子LAT介导细胞的增殖、活化、凋亡等生物学效应,研究GPI类锚固分子CD59介导T细胞信号转导的作用机制。方法:分别构建LAT-EGFP(LAT组,LAT分子高表达)、LAT-M-EGFP(LAT-M组,LAT分子的棕榈酰化位点突变)、neg-EGFP(neg组,阴性对照组)融合蛋白,以慢病毒为载体,转染入Jurkat细胞中,建立稳定表达的细胞株。CD59单克隆抗体交联刺激CD59分子前后,利用激光共聚焦显微镜观察CD59和LAT分子在细胞膜上的定位和分布情况;利用CCK8和流式细胞术检测各组细胞的增殖活性和凋亡情况;通过电镜观察各组细胞中细胞器的变化情况;利用q RT-PCR和Western blot在m RNA和蛋白水平检测T细胞信号转导通路中相关信号分子的表达情况。结果:共聚焦显微镜下观察到各组细胞的转染效率均在80%以上,转染细胞株构建成功。LAT组中,CD59和LAT分子均表达于细胞膜上且部分LAT分子有点簇状聚集区-脂筏所在部位;CD59单克隆抗体交联刺激后,CD59和LAT的点簇状聚集区更为明显且共同定位于脂筏。LAT-M组中,LAT分子在细胞膜上散在分布,未出现点簇状聚集区;CD59抗体作用后无明显变化。与阴性对照组相比,LAT组的细胞增殖活性最高且出现明显的中晚期凋亡现象,LAT-M组细胞的增殖活性最低,中晚期凋亡率最高;CD59抗体作用后,LAT组和neg组细胞增殖活性均明显增高,neg组细胞凋亡减少,LAT组无明显变化,LAT-M组细胞凋亡增加。在基因水平上,LAT组的表达高于neg组和LAT-M组,CD59抗体交联刺激后,LAT组无明显变化,neg组和LAT-M组均较刺激前有所增加。Western blot结果显示,CD59抗体交联后,LAT组和neg组的非磷酸化蛋白表达水平均明显降低,LAT-M组无明显变化。结论:GPI锚固蛋白CD59通过跨膜接头蛋白LAT对T细胞信号转导发挥调控作用,且LAT的棕榈酰化是其发挥功能所必需的。这为其它GPI类锚固分子信号转导的机制研究提供了新视野和新方向。
【关键词】：CD59 Jurkat细胞 LAT 信号转导
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-8
• 技术路线8-9
• 第一章 材料与方法9-19
• 1.1 材料9-10
• 1.1.1 主要实验仪器9
• 1.1.2 病毒与细胞株9
• 1.1.3 主要实验试剂9-10
• 1.2 方法10-19
• 1.2.1 Jurkat细胞的培养10-11
• 1.2.2 慢病毒转染Jurkat细胞11
• 1.2.3 免疫荧光11-12
• 1.2.4 CCK8检测细胞增殖活性12
• 1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡12-13
• 1.2.6 电镜下观察细胞超微结构13
• 1.2.7 qRT-PCR13-15
• 1.2.8 Western blot15-18
• 1.2.9 统计学分析18-19
• 第二章 实验结果19-30
• 2.1 Jurkat细胞的培养19
• 2.2 慢病毒转染Jurkat细胞19-20
• 2.2.1 慢病毒转染后的Jurkat细胞19-20
• 2.2.2 激光共聚焦显微镜观察病毒转染效率20
• 2.3 免疫荧光20-21
• 2.4 CCK8法检测各组Jurkat细胞的增殖活性21-22
• 2.5 流式细胞术检测各组Jurkat细胞的凋亡22-25
• 2.6 电镜下观察细胞的超微结构25-26
• 2.7 qRT-PCR检测T细胞信号转导通路中相关蛋白的表达26-28
• 2.8 Western blot检测相关蛋白的表达28-30
• 第三章 讨论30-32
• 结论32-33
• 参考文献33-36
• 综述36-48
• 综述参考文献44-48
• 攻读学位期间的研究成果48-49
• 附录49-51
• 致谢51-52

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