人源性Rab38荧光融合蛋白表达载体的构建及功能鉴定

发布时间：2017-07-02 11:19

  本文关键词：人源性Rab38荧光融合蛋白表达载体的构建及功能鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的构建人源性Rab38与EGFP融合蛋白表达载体pEGFP-Rab38,观察Rab38在人黑素细胞瘤细胞系A375中的细胞定位情况,为进一步研究Rab38在黑素代谢中的作用提供实验依据。方法收集A375细胞,提取总RNA并逆转录成cDNA。特异性引物PCR扩增Rab38片段并插入pEGFP-C3载体,随后转化至感受态大肠杆菌DH5α中,挑取单克隆菌落进行鉴定。将鉴定正确的重组表达载体转染A375细胞,检测细胞中Rab38和Tyrp1(酪氨酸酶相关蛋白1)的表达并观察Rab38的亚细胞定位。结果 pEGFP-Rab38重组质粒经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确;转染A375细胞后,激光共聚焦显微镜观察到Rab38定位于胞浆中,且大量聚集于细胞核周围;实时定量PCR和Western blot可检测出细胞中EGFP-Rab38融合蛋白的表达,且细胞中Tyrp1的表达明显升高。结论融合蛋白表达载体pEGFP-Rab38成功构建,观察了Rab38在细胞中的定位并初步研究了其对黑素合成关键蛋白Tyrp1的影响,为进一步研究Rab38在黑素代谢中的作用奠定了良好的基础。
【作者单位】： 华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科;武汉市江夏区第一人民医院皮肤科;华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科;
【关键词】： Rab 重组质粒 亚细胞定位 黑素代谢
【基金】：国家自然科学基金(81371728,81472864)
【分类号】：R334.5;Q78
【正文快照】： 细胞内的蛋白和脂类的转运是一些膜性细胞器的产生和彼此间信息交流所必须的基本生物过程。囊泡转运是细胞器之间的信息交流的一种重要形式,这种复杂的生物过程,包括供体细胞器中囊泡状 或管状载体的形成、载体向受体细胞器的移动、载体与受体细胞器的接触和融合[1]。细胞内

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本文编号：509705