Trio基因在小鼠海马区发育及学习记忆中的功能研究

发布时间：2017-07-07 07:12

  本文关键词：Trio基因在小鼠海马区发育及学习记忆中的功能研究

  更多相关文章： Trio基因 海马 大脑发育 小鼠智力

【摘要】：背景介绍：在细胞的生长发育过程中,Trio蛋白是一种非常重要的鸟嘌呤核苷酸交换因子。Trio蛋白拥有多个调节细胞生长的蛋白功能结构域。由于这些功能域的催化作用,Trio蛋白广泛参与细胞生长中细胞骨架的动态调节及肌动蛋白的重构过程,对细胞迁移、神经细胞生长及神经细胞轴突导向等细胞活动起着重要的调节作用。对Trio基因在小鼠发育中功能的研究结果已表明：如Trio基因在小鼠中被完全敲除,小鼠在胚胎期时即会死亡。对这些死亡小鼠胚胎的组织学分析显示：Trio基因完全敲除小鼠胚胎在发育至E18.5天时即会出现大脑皮层和海马结构的细胞排列紊乱及组织发育缺陷。对Nestin-Trio-/-小鼠(Trio基因在整个神经系统中被特异性敲除的小鼠)的研究表明：Trio基因在神经系统中被敲除后,所构建的Nestin-Trio-/-小鼠存活率非常低,出生后即会大量死亡,在成年前这些仔鼠会全部死亡。对出生后幸存的Nestin-Trio-/-小鼠的研究证明：这些小鼠在行为学上出现了共济失调等表型,在神经系统发育上存在着小脑发育缺陷等一系列发育畸形性状。由于Nestin-Trio-/-小鼠在成年前会全部死亡,无法得到成年的Trio基因敲除小鼠以进行成体行为学实验,这限制了Trio基因在成年小鼠发育中的进一步功能研究。为解决这一问题,我们将Trio-Floxed小鼠和EMX1-Cre小鼠进行交配,最终构建了EMX1-Trio-/-小鼠。得到EMX1-Trio-/-小鼠后,我们采取动物行为学、组织学和分子生物学等实验方法对Trio基因在小鼠发育过程中的功能进行了研究。研究目的：通过构建EMX1-Trio-/-小鼠模型的办法来探究Trio基因在小鼠大脑神经发育中所发挥的功能。通过行为学实验来探究Trio基因海马区域特异性敲除后成年小鼠智力所受到的影响。实验方法：将EMX1-Cre小鼠与Trio-Floxed小鼠进行交配得到Trio基因的条件性敲除小鼠即EMX1-Trio-/-小鼠。EMX1-Cre小鼠特异性地在小鼠的大脑皮层及海马区域处表达Cre重组酶并敲除两侧插有loxP位点的Trio基因片段。将得到的EMX1-Trio-/-小鼠饲养至成年,对成年小鼠进行一系列行为学测试以研究小鼠在.Trio基因特异性敲除后的智力水平波动。除了行为学测试外,我们还利用其他实验方法,如组织学石蜡切片HE染色、Western Blot等,对EMX1-Trio-/-小鼠的大脑发育进行研究。小鼠大脑的组织学研究和智力测试的结果相互结合,能够揭示Trio基因在小鼠大脑发育及智力形成中所起到的作用。实验结果：EMX1-Cre小鼠能特异性的在大脑皮层和海马区域组织范围内表达Cre酶以敲除基因组中两侧插有loxP位点的目的基因片段。经研究发现：得到的EMX1-Trio-/-小鼠可以存活至成年时期并被用于成年小鼠的相关研究。对EMX1-Trio-/-,小鼠的研究表明：Trio基因在大脑及海马区域的特异性敲除导致成年的EMX1-Trio-/-小鼠大脑出现了一系列畸形。从外观上观察,和WT小鼠相比,EMX1-Trio-/-,小鼠大脑体积出现了缩小。从组织学切片的HE染色结果上观察：通过Cre重组酶特异性的在小鼠大脑皮层及海马区域敲除Trio基因后,成年EMX1-Trio-/-小鼠的海马结构出现了发育缺陷。海马DG区和CA区的结构出现了扭曲。成年EMX1-Trio-/-小鼠的海马颗粒细胞排列出现了紊乱。对EMX1-Trio-/-成年小鼠的行为学实验结果证明：Trio基因被EMX1-Cre重组酶特异性敲除后,小鼠海马依赖型的智力发育受到了严重的损伤。此外,EMX1-Trio-/-小鼠的体重在P30天前显著低于WT型小鼠,但随着时间的推移体重将会恢复。虽然EMX1-Trio-/-小鼠的体重能够最终赶上WT型小鼠,EMX1-Trio-/-小鼠的脑重则一直低于WT型小鼠,无法恢复正常水平。结论：Trio基因通过控制小鼠大脑及海马的结构发育以控制成年小鼠智力水平的形成。Trio基因在大脑皮层和海马区域的特异性敲除将导致大脑皮层和海马区域因神经细胞生长紊乱而出现发育缺陷,进而导致大脑体积缩小、脑重下降及海马结构畸形。成年EMX1-Trio-/-小鼠的智力因海马畸形而受到损伤,智力出现了下降,在争夺乳汁中处于劣势。摄入的营养不足使得小鼠早期体重出现了下降。综上所述,Trio基因对小鼠大脑及海马区的发育起着至关重要的调节作用,同时对成年小鼠的智力发育及个体形态发育也具有重要的影响。
【关键词】：Trio基因 海马 大脑发育 小鼠智力
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文缩略词表11-12
• 第1章：绪论12-21
• 1. 基因敲除技术简介12-14
• 2. Trio基因的研究进展简介14-21
• 2.1 Trio基因的简介14-15
• 2.2 Trio蛋白的结构研究15-16
• 2.3 Trio蛋白在神经细胞生长中的作用研究16-17
• 2.4 Trio基因在模式动物中的研究17-18
• 2.5 目前所面临的问题及解决办法18-21
• 第2章：实验材料及方法21-42
• 1. 实验材料21-27
• 1.1. 实验动物21-22
• 1.2. 实验试剂22-26
• 1.2.1. 基因型鉴定22-23
• 1.2.2. Western Blot23-24
• 1.2.3. 石蜡切片H&E染色24-26
• 1.3. 杂品与耗材26
• 1.4. 所需仪器26-27
• 2. 实验方法27-42
• 2.1. Trio基因条件敲除小鼠的构建27-28
• 2.2. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的基因型鉴定28-30
• 2.2.1. 提取鼠尾基因组28
• 2.2.2. PCR扩增鼠尾基因组28-29
• 2.2.3. PCR产物琼脂糖凝胶电泳29-30
• 2.3. Western blot检测Trio蛋白30-35
• 2.3.1. 提取海马组织蛋白30-31
• 2.3.2. 蛋白样品的SDS-PAGE电泳31-33
• 2.3.3. Western Blot电泳蛋白转膜33
• 2.3.4. 对转膜后的PVDF膜进行封闭33
• 2.3.5. PVDF膜的抗体孵育33-34
• 2.3.6. 抗体孵育后PVDF膜显影定影34-35
• 2.4. Morris水迷宫测试35-37
• 2.4.1. Morris水迷宫测试的准备工作35-36
• 2.4.2. 获得性训练(Acquisition Phase)36
• 2.4.3. 探查训练(Probe Trial 1)36-37
• 2.4.4. Morris水迷宫实验注意事项37
• 2.5. 场景性恐惧条件测试37-39
• 2.5.1. 场景性恐惧测试步骤38-39
• 2.5.2. 场景性恐惧测试注意事项39
• 2.6. 组织切片分析39-42
• 2.6.1. 小鼠大脑石蜡切片步骤39-41
• 2.6.2. 小鼠大脑石蜡切片H&E染色41-42
• 2.7. 数据处理及统计分析42
• 第3章：实验结果42-49
• 1. Trio基因在EMX1-Trio~(-/-)小鼠海马组织中被敲除42-43
• 2. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的总体形态出现异常43-44
• 3. EMX1-Trio~(-/-)成年小鼠的智力水平显著下降44-47
• 4. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的海马结构出现畸形47-49
• 第4章：讨论49-57
• 1. 小鼠的发育受到Trio基因的调控51-54
• 1.1 Trio基因控制小鼠大脑的发育51-52
• 1.2 Trio基因敲除影响了EMX1-Trio~(-/-)小鼠的体重及脑重52-54
• 1.2.1 小鼠的体重受到Trio基因的调控53
• 1.2.2 EMX1-Trio~(-/-)小鼠的脑重受到Trio基因敲除的影响53-54
• 2. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的海马损伤导致小鼠的学习能力下降54-56
• 2.1 小鼠的海马决定着小鼠智力水平的形成54-55
• 2.2 Trio基因的敲除导致EMX1-Trio~(-/-)小鼠海马的畸形及智力的下降55-56
• 3. EMX1-Trio~(-/-)小鼠可为人类神经性疾病的研究提供材料56-57
• 第5章：结论57-58
• 主要参考文献58-62
• 攻读学位期间发表的论文62
• 致谢62-63
• 学位论文评阅及答辩情况表63

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本文编号：529227