EV71-CA16联合灭活疫苗免疫保护效果研究

发布时间：2017-07-08 13:23

  本文关键词：EV71-CA16联合灭活疫苗免疫保护效果研究

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【摘要】：目的：利用肠道病毒71型-柯萨奇病毒A组16型(EV71-CA16)联合灭活疫苗,对动物体内和体外的保护效果进行研究。尝试用致敏的T淋巴细胞通过腹腔过继回输的方法建立过继免疫乳鼠模型,对细胞免疫反应与保护作用之间的关系进行探索性研究。方法：用Vero细胞培养疫苗候选株EV71-KM和CA16-KM,病毒收获后经β-丙内酯灭活,A1(OH)3佐剂吸附,制成实验性疫苗。实验性疫苗分别于第0和14天经肌肉注射免疫8周龄ICR雌鼠,100μ1/只,联合免疫组免疫剂量分为：EV71 256EU+CA16 32EU组、EV71 256EU+CA16 320EU组与EV71 256EU+CA16 960EU组,对照组注射等体积PBS,第一次免疫后1h与雄鼠合笼,随其交配,分娩后24h内采集母鼠和乳鼠的血液用于血清中和抗体滴度的检测；同时用100LD50强毒株(EV71-CC, CA16-CC)经颅内注射进行攻毒,连续21天观察其临床症状与死亡情况,评价联合疫苗对乳鼠的保护作用。用CA16-KM灭活疫苗(抗原含量为32EU/100μl)经腹腔注射免疫1日龄SPF级ICR乳鼠2次,间隔2周,40山/只,对照组注射等体积PBS,末次免疫后第7天,以安乐法处死小鼠,无菌条件下取出脾脏,分选脾脏单个核细胞、T细胞、B细胞、记忆性T细胞、效应性T细胞,将分选的细胞经腹腔注射回输1日龄乳鼠,回输2h后用强毒株(CA16-CC)经颅内注射攻击,连续21天观察其临床症状与死亡情况,评价细胞免疫反应与保护作用之间的关系。结果：各实验组未检测到血清特异性中和抗体；EV71-KM灭活疫苗和CA16-KM灭活疫苗之间没有交叉保护作用。两种疫苗单独免疫雌鼠能够完全保护其新生乳鼠抵抗相应病毒致死剂量的攻击；联合免疫时,EV71 256EU+CA16 32EU剂量组,对EV71的保护率为100%,对CA16的保护率及EV71和CA16同时攻毒的保护率为0%； CA16免疫剂量提高到320EU时,对EV71和CA16同时攻毒总的保护率为30%；对EV71的保护率为100%,对CA16保护率为67%。CA16免疫剂量提高到960EU时,对两个病毒同时攻击的保护率为70%,对EV71和CA16分别攻击的保护率均达到100%,,对照组的保护率为0%。CA16灭活疫苗免疫组小鼠脾脏单个核细胞以2×107/只回输ICR乳鼠,对CA16攻击产生100%的保护；免疫组T细胞以1×107/只回输ICR乳鼠,对CA16攻击产生60%的保护；免疫组B细胞以1×107/只回输ICR乳鼠,对CA16的攻击产生56%的保护；免疫组CD4+T和CD8+T细胞以5.0x106/只回输裸乳鼠、免疫组记忆性T细胞、效应性T细胞以2.0x105/只回输裸乳鼠后对病毒攻击均无保护,对照组对病毒攻击均无保护。结论：EV71-CA16联合免疫动物可诱导产生针对两种病毒的免疫反应。EV71 256EU在与三个CA16不同配比剂量组中均可产生完全保护；CA16低剂量组没有有保护作用,提高剂量后,保护率也提高。致敏的脾脏单个核细胞过继回输至新生乳鼠体内可完全保护其抵抗CA16的攻击。致敏的T细胞、B细胞过继回输至新生乳鼠体内可在一定程度上部分保护其抵抗CA16的攻击。
【关键词】：EV71-CA16联合灭活疫苗 保护效果 乳鼠 过继回输 细胞免疫
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-15
• 1 EV71和CA16预防性疫苗的研究11-13
• 2 疫苗有效性的评价方法13-15
• 第一部分 试验用EV71-CA16联合灭活疫苗的制备15-26
• 一、实验材料15-17
• 二、实验方法17-22
• 1 Vero细胞的复苏与培养17-18
• 2 疫苗候选株EV71-KM、CA16-KM的培养18
• 3 荧光PCR法鉴定EV71-KM、CA16-KM病毒株18-19
• 4 EV71-KM、CA16-KM病毒株滴度的测定19-20
• 5 实验用灭活疫苗的制备20
• 6 EV71-KM、CA16-KM病毒株灭活后残余毒力的测定20
• 7 EV71-KM、CA16-KM病毒株灭活后抗原含量的测定20-22
• 三、实验结果22-24
• 1 细胞状态22
• 2 EV71-KM、CA16-KM病毒株的荧光PCR鉴定结果22-23
• 3 EV71-KM、CA16-KM病毒株CCID_(50)的测定结果23
• 4 EV71-KM、CA16-KM病毒株灭活后残余毒力的检测结果23
• 5 EV71-KM、CA16-KM病毒株灭活后抗原含量的测定结果23-24
• 四、讨论24-25
• 五、小结25-26
• 第二部分 EV71-CA16联合灭活疫苗对小鼠保护作用的研究26-43
• 一、实验材料26-28
• 二、实验方法28-32
• 1 Vero细胞的复苏与培养28
• 2 攻击毒EV71-CC、CA16-CC的培养28
• 3 荧光PCR法鉴定EV71-CC、CA16-CC病毒株28
• 4 EV71-CC、CA16-CC病毒株滴度的测定28-29
• 5 EV71-CC、CA16-CC病毒株LD_(50)的测定29
• 6 免疫方案的研究29-30
• 7 EV71-KM和CA16-KM灭活疫苗的交叉保护实验30-31
• 8 EV71-CA16联合灭活疫苗对新生乳鼠的保护作用31
• 9 血清中和抗体效价检测31-32
• 三、实验结果32-41
• 1 细胞状态32-33
• 2 荧光PCR法鉴定EV71-CC、CA16-CC病毒株33-34
• 3 EV71-CC、CA16-CC病毒株CCID_(50)的测定结果34
• 4 EV71-CC、CA16-CC病毒株LD_(50)的测定结果34-37
• 5 免疫方案的研究37-39
• 6 EV71-KM和CA16-KM交叉保护实验39
• 7 EV71-CA16联合灭活疫苗对新生乳鼠的保护作用39-40
• 8 血清中和抗体效价检测40-41
• 四、讨论41-42
• 五、小结42-43
• 第三部分 过继回输在疫苗细胞免疫反应评价中的探索性研究43-54
• 一、实验材料43-44
• 二、实验方法44-49
• 1 免疫动物44
• 2 小鼠脾脏单个核细胞的分离44-45
• 3 CA16灭活疫苗免疫后小鼠免疫细胞亚群的流式检测45
• 4 小鼠CD3ε~+T淋巴细胞的磁珠分选45-46
• 5 小鼠B淋巴细胞的磁珠分选46-47
• 6 CD4~+T和CD8~+T淋巴细胞的磁珠分选47-48
• 7 效应性T淋巴细胞、记忆性T淋巴细胞的流式分选48
• 8 细胞富集及细胞活性检测48
• 9 细胞过继性回输48-49
• 三、实验结果49-52
• 1 细胞活性检测49
• 2 CA16灭活疫苗免疫后小鼠免疫细胞亚群的流式分析49-50
• 3 小鼠脾脏单个核细胞回输结果50
• 4 小鼠CD3ε~+T淋巴细胞回输结果50-51
• 5 小鼠B淋巴细胞回输结果51
• 6 CD4~+和CD8~+T淋巴细胞回输结果51
• 7 记忆性T细胞、效应性T细胞的流式分选及回输结果51-52
• 四、讨论52-53
• 五、小结53-54
• 参考文献54-59
• 附录59-60
• 致谢60-62
• 个人简历62-63

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