脂肪酸延长酶ELO家族与脂毒关系研究

发布时间：2017-08-14 01:07

  本文关键词：脂肪酸延长酶ELO家族与脂毒关系研究

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【摘要】：当长链脂肪酸的积累超过脂肪组织的储存能力，会在非脂肪组织过度沉积，造成脂毒，进而引发脂毒性凋亡，是多种代谢性疾病的主要病因。脂肪酸延长酶家族参与脂肪酸代谢流，且与膜脂的代谢密切相关。但脂肪酸延长酶与脂毒关系并不清楚。酵母脂肪酸延长酶ELO家族包括Elo1、Elo2、Elo3，其中Elo2和Elo3负责将长链脂肪酸延长到极长链脂肪酸，并参与细胞多项生命活动和功能的调节，在真核生物中有很高的保守性，因此选择酵母研究相关机制是很好的模型。 本文首先建立了油红O比色快速检测酵母中性脂含量的方法。利用油红O比色法和薄层层析法分析野生型BY4741和脂肪酸延长酶缺陷菌株脂质含量，发现elo缺陷菌株中性脂含量积累。油酸处理后，胞内中性脂含量升高。采用气相色谱-质谱联用技术分析脂肪酸组成，结果显示ELO3敲除后，C26脂肪酸基本检测不到，而C20与C22脂肪酸会累积；ELO2缺失后，C26脂肪酸的含量也明显降低。而油酸的处理会增加BY4741胞内总的极长链脂肪酸的比例。油酸处理后，elo2△和elo3△的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例增大。 极长链脂肪酸延长酶ELO2和ELO3缺陷后，细胞对油酸高度敏感。而ELO1突变株无油酸敏感表型。同时加入抗氧化剂VC或NAC，能有效补救油酸造成突变株的生长抑制。利用DCFH-DA检测胞内ROS水平，显示油酸处理后elo2△和elo3△胞内ROS含量积累。接下来对胞内抗氧化酶活性及抗氧化剂含量的进行测定，显示油酸处理后野生型及elo1△胞内抗氧化酶活性升高，而elo2△和elo3△胞内的CAT和SOD酶活性急剧降低；油酸处理后，还原型谷胱甘肽GSH含量均降低。通过对胞内MDA及PCO含量的测定，显示油酸处理后其含量均升高，表明油酸对酵母细胞造成了氧化损伤。尤其是elo2△和elo3△胞内MDA含量的升高有极显著性差异。elo2△和elo3△对两性霉素B等抗生素具有高度敏感性。对其麦角固醇含量的检测，显示含量低于野生型酵母菌株。利用PI染色检测细胞膜的通透性，发现elo2△和elo3△的膜通透性明显高于野生型细胞，且油酸处理后膜通透性显著提高。结果表明极长链脂肪酸延长酶的缺失不仅引起细胞内脂肪酸组成的变化，抗油酸诱导的氧化能力下降，同时还导致膜脂麦角固醇含量降低，，细胞膜稳定性下降。 通过构建elo3△背景的酵母必需基因超表达文库，在高浓度油酸培养基上筛选抵抗油酸胁迫的菌株。经过质粒测序得到一系列油酸响应基因，包括复制起始因子，参与复制修复、mRNA剪接的亚基，参与泛素化降解的ATP酶，及参与合成血红素A的铁氧还蛋白等。筛选结果证实了氧化应激在脂毒性中的重要作用。同时，表明极长链脂肪酸延长酶对维护细胞膜系统的稳定，抵抗油酸胁是不可缺少的。进一步对这些抗性基因进行功能研究，将会更加深入地了解脂毒机制。
【关键词】：脂肪酸延长酶 脂代谢 脂毒性 氧化胁迫
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411;Q55
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目录9-11
• 缩略语11-12
• 1 绪论12-18
• 1.1 脂毒性及其机制研究进展12-16
• 1.2 脂肪酸延长酶的研究进展16-18
• 2 实验设计方案18-20
• 2.1 实验目的、意义18
• 2.2 实验内容18-19
• 2.3 实验流程图19-20
• 3 酵母中性脂快速检测及积累动态分析20-29
• 3.1 材料与试剂20-22
• 3.2 方法22-23
• 3.3 结果23-27
• 3.4 讨论27-29
• 4 ELO 家族与脂代谢的关系29-47
• 4.1 材料与试剂29-30
• 4.2 方法30-36
• 4.3 结果36-46
• 4.4 讨论46-47
• 5 脂毒性胁迫机制47-66
• 5.1 材料与试剂47-49
• 5.2 方法49-56
• 5.3 结果56-64
• 5.4 讨论64-66
• 6 抗油酸胁迫基因的筛选66-74
• 6.1 材料与试剂66-67
• 6.2 方法67-69
• 6.3 结果69-73
• 6.4 讨论73-74
• 总结74-76
• 参考文献76-83
• 攻读学位期间的研究成果83-84
• 致谢84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;蜗牛酶的制备和对酵母细胞壁的作用[J];生物化学与生物物理进展;1978年06期

2 林汝榕;邢炳鹏;蔡文旋;柯秀蓉;林锡煌;;苏丹黑B染色处理细胞技术在快速检测微藻油脂含量中的应用[J];台湾海峡;2011年02期

本文编号：669921