生长激素长期刺激导致肝脏生长激素不敏感效应的研究

发布时间：2017-08-25 00:25

  本文关键词：生长激素长期刺激导致肝脏生长激素不敏感效应的研究

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【摘要】：研究背景生长激素(growth hormone,GH)是一种分子量22124D,含191个氨基酸残基的单链多肽类激素,其由人第17号染色体q22-24节段的基因编码,由垂体前叶的促生长激素细胞合成、贮存与分泌,在人体呈脉冲式分泌。生长激素是人体重要的激素,其主要作用为促进儿童时期身高的增长。除可促进人体的生长与发育,促进骨骼钙质沉积外,还可调节脂肪与能量代谢,刺激免疫系统等,并能提高人体在应激状态下的血清葡萄糖与游离脂肪酸浓度。生长激素缺乏(growth hormone deficiency,GHD)可引起多种疾病,在儿童主要表现为发育障碍、身材矮小,在成人则表现为代谢紊乱、骨质疏松甚至心理障碍等。目前治疗生长激素缺乏的唯一方法为补充外源性生长激素。在应用基因重组技术人工合成生长激素——重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)之前,用于临床治疗的生长激素是从人类尸体的垂体中提取的,因而产量极低,使用极其严格,且难以满足需求。直至1985年,垂体源性生长激素由于用药安全问题被禁止使用,重组人生长激素获得FDA批准用于治疗儿童生长激素缺乏,开始全面取代垂体源性生长激素。此后重组人生长激素的应用范围逐渐拓宽,不仅被用于治疗由于生长激素缺乏而造成的儿童生长发育障碍如身材矮小、阴茎发育不良、骨骼生长缓慢等,还被用于治疗成人生长激素缺乏造成的肌肉质量减轻、骨质疏松等,以及与生长激素缺乏无关的儿童生长发育障碍如特发性矮小、特纳综合征(Turner's syndrome,TS);另外由于重组人生长激素可以逆转许多严重分解状态下的营养与代谢障碍,尚被用于慢性肾衰、烧伤、重大外科手术、败血症以及HIV/AIDS的消耗状态等的辅助治疗。伴随着重组人生长激素在临床上的广泛使用,出现了各种药物不良反应,成为药物使用安全性的一个重要问题。其不良反应包括药物过敏,营养与代谢紊乱,促进肝纤维化,脊柱侧弯,白血病风险,胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),心肺意外甚至猝死。而对于这种由于应用外源性生长激素而产生的诸多不良反应的分子机制,尚有许多我们并不清楚,故而,研究生长激素作用于细胞的分子机制或许可以帮助我们理解外源性生长激素应用导致的不良反应可能的原因,进而为解决这一问题提供帮助。生长激素促进机体生长发育的机制主要有2种,均起始于与靶细胞细胞膜上的生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)的结合,进而激活不同的信号通路。其一为与GHR结合后激活MAPK/ERK信号通路,直接刺激软骨细胞的分裂增殖；另一机制则是与GHR结合后激活JAK-STAT信号通路,刺激胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的合成。IGF-1对多种组织均有刺激生长的作用,可同时刺激软骨细胞和成骨细胞生长。此外,生长激素与GHR的结合还能激活RAS-RAF-ERK通路,PI3K通路等多个信号通路。肝脏是生长激素在人体最重要的靶器官,并且是IGF-1主要的合成场所,而生长激素在肝脏细胞作用的信号转导通路以JAK-STAT信号通路为主,故本研究选择以生长激素在肝脏内的JAK-STAT通路的信号转导为靶点,研究生长激素长期刺激对肝脏JAK-STAT信号通路的影响。肝细胞中JAK-STAT通路的信号转导开始于生长激素与生长激素受体二聚体的结合。生长激素的蛋白结构中有4个可与GHR结合的单环结构,GHR以二聚体形式与之结合后,GHR的胞内段接着与2分子Janus激酶2(Janus kinase2, JAK2)结合,结合于GHR的JAK2可激活自身与GHR的磷酸化,磷酸化的GHR又可激活JAK2的磷酸化,两者形成交叉磷酸化,与生长激素一起,三者结合形成GH-GHR-JAK2多聚体,该多聚体可为下游的信号分子提供结合位点。信号转导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STATs)家族中的STAT1、STAT3和STAT5均可在JAK-STAT通路中被激活,但STAT5被认为是其中关键的信号分子。[18]STAT5有两个同源异构体——STAT5a和STAT5b,分别由鼠11号染色体和人17号染色体的一对等位基因编码。[19]GH-GHR-JAK2多聚体形成后,STAT5即与多聚体的信号分子结合位点结合,被磷酸化激活形成P-STAT5,随后P-STAT5聚合形成二聚体转入细胞核,结合于DNA上特定的反应元件(常为一个反向重复的TTCN3GAA序列),调控靶基因如SOCS-2 (Suppressor of cytokine signaling 2)及IGF-1基因的转录。本课题选择同时从细胞水平和在体水平研究长期应用外源性生长激素对肝脏JAK-STAT信号通路的影响。[研究目的]生长激素在人体最重要的靶器官是肝脏,其在肝脏中主要的信号转导通路是JAK-STAT通路,而STAT5是该信号通路最主要的效应信号因子,本研究将同时从细胞水平与在体水平,检测生长激素长期刺激下肝脏STAT5磷酸化水平的变化,进而探究生长激素长期刺激对肝脏JAK-STAT信号通路的影响。[研究方法]1.细胞实验部分：本课题选择人肝癌细胞系Hep G2,以含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃恒温CO2培养箱中培养。1.1 Hep G2对数生长期细胞均匀传代至12孔细胞培养板的8个孔,以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,待细胞密度增长至90%左右时将培养基换为不含血清的DMEM进行9小时血清饥饿,然后将细胞分为4组：Omin rhGH组,1Omin rhGH组,30min rhGH组与50min rhGH组,每组2孔。按分组情况予各组工作浓度3000ng/ml的重组人生长激素分别刺激50分钟、30分钟、10分钟、0分钟,每组添加刺激时其余各组予等体积无血清DMEM。刺激结束后以RIPA裂解液冰上裂解细胞,提取细胞总蛋白检测P-STAT5水平。1.212孔细胞培养板中放置清洁光滑的无菌盖玻片,HepG2对数生长期细胞均匀传代接种6个孔,控制细胞密度在30%左右,以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,待细胞贴壁牢固后立即将培养基换为不含血清的DMEM进行9小时血清饥饿,然后将细胞分为3组：Omin rhGH组,20min rhGH组,60min rhGH组,每组2孔。按分组情况予各组工作浓度3000ng/ml的重组人生长激素分别刺激60分钟、20分钟、0分钟,每组添加刺激时其余各组予等体积无血清DMEM。刺激结束后常温下移出细胞玻片,以4%多聚甲醛固定后检测P-STAT5水平。1.3 Hep G2对数生长期细胞均匀传代至12孔细胞培养板的4个孔,以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,控制细胞牢固贴壁时细胞密度在40-50%左右,之后将培养基换为含2%胎牛血清的DMEM,并将细胞分为生长激素长期刺激组与对照组,每组2孔。GH长期刺激组每日予工作浓度3000ng/ml的重组人生长激素刺激共3天,对照组每日予等体积无血清DMEM,控制末次添加刺激后24小时细胞密度增长至90%左右,之后将培养基换为不含血清的DMEM进行9小时血清饥饿,最后再予每组添加一次单剂量重组人生长激素(工作浓度3000ng/ml)作为阈上刺激,刺激30分钟后将细胞置于冰上以RIPA裂解液裂解,提取细胞总蛋白检测P-STAT5水平。2.动物实验部分：本课题选择6-8周龄的健康BALB/c雄性小鼠12只随机分为生长激素长期刺激组与对照组,每组6只。GH长期刺激组按1ug/g体重/次的剂量予每日1次腹腔注射重组人生长激素,对照组注射等体积生理盐水,共3周。末次注射后16小时于次日上午8：00处死。处死前30分钟每组随机选出3只予腹腔注射1次单剂量重组人生长激素(1ug/g体重),其余6只注射等体积生理盐水。12只小鼠最终分为4组：对照组,GH单剂量刺激组,GH长期刺激组,GH长期+单剂量刺激组。全部刺激完成后,所有小鼠以水合氯醛充分麻醉,迅速摘取小鼠肝脏存于液氮中,之后移至-80℃超低温冰箱保存备用。冰上研磨小鼠肝脏组织,以RIPA裂解液冰上裂解细胞,提取组织蛋白检测P-STAT5水平。实验过程中,确保每日腹腔注射的时间一致,小鼠处死的时间点相同。每次注射两组交叉进行。3.蛋白信号分子的测定3.1实验1.1与实验1.3中提取的Hep G2细胞总蛋白,及实验2中提取的小鼠肝脏组织蛋白,应用蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测P-STAT5水平。3.2 Hep G2细胞爬片,应用细胞免疫荧光法(Immunofluorescence)染色后于荧光显微镜下观察P-STAT5蛋白信号的荧光强度,检测P-STAT5水平。4.统计分析全部实验数据采用WPS Excel 2015记录,并使用SPSS 20.0进行统计学分析。实验结果以“算术平均值±标准差(arithmetic mean±standard deviation, M±SD) "表示。两组间比较采用两独立样本t检验(Independent Samples T Test)或Satterthwaite近似t检验(满足或不满足方差齐性)。以P值0.05为存在显著性差异,有统计学意义。[研究结果]1.体外研究(细胞培养试验)中生长激素长期刺激对HepG2细胞P-STAT5水平的影响1.1实验结果显示,50min rhGH组的HepG2细胞P-STAT5水平(灰度值：0.55±0.18)显著低于1Omin rhGH组与30min rhGH组的Hep G2细胞(灰度值分别为1.45±0.39,1.49±0.22),(P值=0.023 vs. 1Omin rhGH组,P值=0.005 vs.30min rhGH组)；而1OminrhGH组与30min rhGH组的HepG2的P-STAT5水平则无显著差异(P值=0.879)。1.2实验结果显示,60min rhGH组的HepG2细胞的P-STAT5蛋白信号荧光强度明显弱于20min rhGH组的HepG2细胞。1.3实验结果显示,与对照组(灰度值：1.41±0.41)相比,GH长期刺激组Hep G2细胞的P-STAT5水平(灰度值：0.76±0.31)显著下降(P值=0.026)。2.体内研究(动物实验)中生长激素长期刺激对小鼠肝脏P-STAT5水平的影响2.1实验结果显示,与对照组(灰度值：1.47±0.45)相比,GH长期刺激组的小鼠肝脏P-STAT5水平(灰度值：0.42±0.06)显著降低。(P值=0.016)2.2实验结果显示,GH长期+单剂量刺激组小鼠肝脏P-STAT5水平(灰度值：2.05±0.33)显著高于GH长期刺激组的小鼠(灰度值：0.17±0.03)。(P值=0.01)2.3实验结果显示,GH长期+单剂量刺激组小鼠肝脏的P-STAT5水平(灰度值：1.29±0.34)显著低于GH单剂量刺激组(灰度值：3.48±0.88)。(P值=0.036)[研究结论]1.在细胞培养水平,生长激素长期刺激可抑制STAT5磷酸化,抑制JAK-STAT信号通路。2.在健康小鼠模型中,生长激素长期刺激可抑制STAT5磷酸化,抑制JAK-STAT信号通路,并可致小鼠肝脏对生长激素的敏感性降低。3.结合本研究前期实验结果推论,长期的生长激素刺激可能导致肝脏SOCS-3基因转录水平增高,并由此抑制了STAT5的磷酸化水平,从而抑制了JAK-STAT信号通路,降低肝脏对生长激素刺激的敏感性。
【关键词】：生长激素 肝脏 STAT5 磷酸化
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 前言19-24
• 第二章 材料与方法24-50
• 一、细胞实验部分24-38
• 1. 实验细胞株24
• 2. 主要实验试剂24-25
• 3. 实验中使用的抗体25-26
• 4. 主要溶液的配制26-28
• 5. 主要仪器、设备和器材28-30
• 6. 分组干预方案30-32
• 7. 提取细胞总蛋白32-33
• 8. 检测样品蛋白浓度33-34
• 9. Western blot操作步骤34-37
• 10. 免疫荧光染色步骤37-38
• 11. 统计学分析38
• 二、动物实验部分38-50
• 1. 实验动物38
• 2. 主要实验试剂38-40
• 3. 试验中使用的抗体40
• 4. 主要溶液的配制40-42
• 5. 主要器材、仪器和设备42-43
• 6. 分组干预方案43-45
• 7. 检测样品蛋白浓度45-46
• 8. Western blot操作步骤46-49
• 9. 统计学分析49-50
• 第三章 结果50-70
• 一、细胞实验部分50-58
• 二、动物实验部分58-70
• 第四章 讨论70-73
• 第五章 小结73-75
• 参考文献75-78
• 中英文缩略词对照表78-79
• 在读期间已经发表和将要发表的论文79-80
• 致谢80-84

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