RNA解旋酶Rig-I对巨噬细胞的影响及作用机制研究

发布时间：2017-08-25 01:25

  本文关键词：RNA解旋酶Rig-I对巨噬细胞的影响及作用机制研究

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【摘要】：第一部分Rig-I对巨噬细胞的数量及凋亡的影响RIG-I(retinoic acid-inducible gene-I)最初是在全反式维甲酸(all trans-retinoic acid,ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞系NB4分化过程中被发现显著上调的基因。目前普遍认为,Rig-I是细胞质内病原模式识别受体的一种,通过特异性识别外源RNA在宿主抗病毒先天免疫功能中发挥重要作用。在病毒感染情况下,Rig-I通过其RD结构域识别相应病毒RNA,与下游信号分子IPS-1(Interferon-beta promoter stimulator 1,MAVS/Cafrdif/VISA)发生相互作用,从而激活下游的IRF3(IFN regulatory factor 3)和NF-κB信号通路,产生I型干扰素和炎症因子,抵抗病毒入侵。但在我们以往的研究中,意外发现Rig-I基因缺失小鼠的抗细菌免疫能力低下,易发生条件性致病菌感染。Rig-I基因剔除纯合子小鼠由于B细胞分化缺陷和免疫球蛋白转换受阻导致眼部及颈部皮肤易发生条件性致病菌-木糖型葡萄球菌(S.xylosus)感染。另外Rig-I基因剔除小鼠容易发生结肠炎、T细胞活化缺陷和粒细胞的过度增殖。这说明Rig-I在抗病毒以外,在细菌免疫反应中也发挥重要作用。另外细胞培养发现Rig-I可以通过调节GTP酶家族Rac/Cdc42的活性来影响细胞骨架蛋白actin的重组,从而促进巨噬细胞对细菌的吞噬能力,Rig-I基因剔除小鼠对E.coli的吞噬能力减弱。巨噬细胞是天然免疫免疫系统防御体系的重要一员。我们利用现有的Rig-I基因剔除小鼠模型,采用流式细胞术的方法,对小鼠的腹腔巨噬细胞总数和凋亡以及大巨噬细胞(Large peritioneal macrophages,LPM)和小巨噬细胞(Small peritoneal macrophages,SPM)的数量进行分析。与野生型小鼠相比,Rig-I基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞的总数明显减少、凋亡增加以及腹腔巨噬细胞LPM和SPM的数量上都发生显著减少。这说明Rig-I对小鼠的腹腔巨噬细胞的数量起着重要调节作用,这可能与Rig-I基因敲除的小鼠易发生条件致病菌感染存在某种的联系。第二部分Rig-I对LPS诱导的巨噬细胞增殖、凋亡及功能的作用研究位于革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是巨噬细胞的潜在激活剂。LPS通过激活TLR4启动天然免疫反应。本研究我们以LPS诱导巨噬细胞为模型,探讨Rig-I基因对LPS诱导巨噬细胞增殖、凋亡和细胞因子分泌等生物学功能的影响及其作用机制。以不同剂量的LPS刺激Rig-I基因沉默和过表达的小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞,采用CCK8和流式细胞术检测细胞的生长状态;采用q PCR方法检测细胞因子TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6相关基因的表达水平;利用transwell检测巨噬细胞的迁移;对巨噬细胞与细胞外基质的粘附作用进行分析;采用Western blot方法检测LPS诱导的TLR4信号通路的相关蛋白表达水平。CCK8和流式细胞术结果显示Rig-I促进巨噬细胞的增殖并抑制LPS诱导的细胞凋亡,q PCR结果表明Rig-I促进巨噬细胞中TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6基因的表达。进一步实验证实Rig-I通过激活AKT及其下游蛋白p-38、NF-κB和Bcl-x L等抑制细胞凋亡并促进细胞因子的表达。因此,本研究首次证实了Rig-I可通过AKT信号通路对LPS诱导的巨噬细胞增殖、凋亡及功能进行调节。
【关键词】：Rig-I 巨噬细胞 天然免疫 Rig-I 细胞因子 TLR4信号通路
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• 英文摘要6-12
• 中英文缩略词对照表12-15
• 第一部分 Rig-I对巨噬细胞的数量及凋亡的影响15-32
• 1. 引言15-17
• 2. 实验材料17-20
• 2.1 主要生化与分子细胞生物学试剂17-18
• 2.2 主要溶液配方18
• 2.3 主要仪器设备18-19
• 2.4 实验动物19
• 2.5 PCR引物设计与合成19-20
• 3. 实验方法20-25
• 3.1 鼠尾DNA的提取20
• 3.2 Rig-I基因敲除老鼠的鉴定20-21
• 3.3 小鼠腹腔巨噬细胞的提取和培养21-22
• 3.4 腹腔巨噬细胞的凋亡22
• 3.5 腹腔巨噬细胞比例的检测22
• 3.6 腹腔巨噬细胞的分群22-23
• 3.7 RT-PCR检测凋亡相关基因的表达水平23-25
• 3.8 统计分析25
• 4. 实验结果25-29
• 4.1 Rig-I基因增加腹腔巨噬细胞的比例25-26
• 4.2 Rig-I基因抑制腹腔巨噬细胞的凋亡26-27
• 4.3 Rig-I基因对腹腔巨细胞的分群发挥重要作用27-29
• 5. 讨论29-31
• 6. 本部分总结31-32
• 第二部分 Rig-I对LPS诱导的巨噬细胞增殖，凋亡及功能的作用研究32-62
• 1. 引言32-39
• 2. 实验材料39-42
• 2.1 材料39
• 2.2 主要化学与分子生物学实验试剂39-40
• 2.3 主要试剂配方40
• 2.4 PCR引物设计与合成40-41
• 2.5 实验仪器41-42
• 3. 实验方法42-48
• 3.1 细胞复苏，培养，冻存和计数42
• 3.2 质粒提取，纯化和酶切鉴定42-44
• 3.3 Rig-I基因沉默Raw264.7 细胞株构建44
• 3.4 Rig-I高表达Raw264.7 细胞株构建44
• 3.5 LPS处理Raw264.7 细胞株44-45
• 3.6 细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK8 ）检测细胞增殖45
• 3.7 流式细胞术检测细胞凋亡45
• 3.8 qPCR检测细胞因子的表达量45-46
• 3.9 细胞迁移实验46
• 3.10 细胞粘附试验46-47
• 3.11 Western Blot47
• 3.12 统计分析47-48
• 4. 结果48-58
• 4.1 Rig-I基因促进巨噬细胞的增殖48-49
• 4.2 Rig-I基因抑制LPS诱导的巨噬细胞凋亡49-50
• 4.3 Rig-I促进LPS诱导的巨噬细胞细胞因子的表达50-52
• 4.4 Rig-I促进LPS诱导的巨噬细胞的迁移52-53
• 4.5 Rig-I促进LPS诱导的巨噬细胞与细胞外基质的粘附作用53-55
• 4.6 Rig-I促进LPS诱导的AKT磷酸化和下游NF-κB通路的激活55-58
• 5. 讨论58-61
• 6. 本部分结论61-62
• 参考文献62-68
• 致谢68-71
• 攻读硕士期间发表的学术论文71

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