弓形虫棒状体蛋白ROP18对神经干细胞凋亡与分化的影响及机制研究

发布时间：2017-10-14 17:22

  本文关键词：弓形虫棒状体蛋白ROP18对神经干细胞凋亡与分化的影响及机制研究

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【摘要】：目的探讨弓形虫棒状体蛋白ROP18对神经干细胞凋亡、分化的影响及其机制。方法(1)将弓形虫棒状体蛋白ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,PCR、测序鉴定正确的重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP-ROP18,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定。(2)以MOI=70的ROP18重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,转染后不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况。(3)转染48h后用CCK-8法检测C17.2的增殖情况；24h后采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活情况。(4)2%N2+DMEM/F12培养液诱导C17.2分化,用ROP18重组腺病毒,空载体腺病毒(MOI=70)干预细胞3d,5d后,免疫荧光检测神经元特异性标志物βⅢ-tubulin的表达。(5) 2%N2+DMEM/F12培养液诱导C17.2分化,用ROP18重组腺病毒,空载体腺病毒(MOI=70)干预细胞3d,5d后,收集细胞,提取总蛋白,采用Western blot法检测βⅢ-tubulin水平。(6)2%N2+DMEM/F12培养液诱导C17.2分化,用ROP18重组腺病毒,空载体腺病毒(MOI=70)干预细胞3d,5d后,采用Western blot法检测Wnt信号通路中相关蛋白β-catenin(胞浆和胞核)、Ngnl和Ngn2的表达水平。用双荧光素酶试剂盒检测Wnt信号通路的活性结果(1)重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP-ROP18经测序鉴定,目的DNA序列与靶序列100%吻合。(2)转染48h后用CCK-8检测ROP18重组腺病毒组细胞增殖活力为58.13%±7.373%,较腺病毒对照组(85.34%±6.092%)及细胞对照组(81.51%±3.415%)均有明显的下降(P0.05)。24h后采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测结果显示ROP18重组腺病毒组细胞凋亡率为31.07%±10.05%,较腺病毒对照组(2.707%±0.05044%)及细胞对照组(0.7775%±0.05250%)均有明显的下降(P0.001)。Western blot检测ROP18重组腺病毒转染组,C17.2神经干细胞内的caspase-3蛋白活性片段的表达量(0.5197±0.06481)较腺病毒空载体对照(0.1777±0.09308)和细胞对照组(0.0340±0.01353)均有明显升高(P0.05,P0.01)。(3)C17.2细胞在诱导分化后3d、5d,免疫荧光检测结果显示ROP18重组腺病毒组神经元标记蛋白βⅢ-tubulin荧光信号较诱导分化组明显减弱。(4) Western blotting检测结果显示分化组,空载体腺病毒组,ROP18重组腺病毒组,在诱导分化后3d βⅢ-tubulin蛋白水平分别为1.563±0.3846,0.7597±0.1081,0.3100±0.09445(P0.05),在诱导分化后5d βⅢ-tubulin蛋白水平分别为1.452±0.2628,0.9057±0.1222,0.4297±0.0845(P0.05)(5)分化组,空载体腺病毒组和ROP18重组腺病毒组在诱导分化后3d检测到核内β-catenin相对表达量分别为1.446±0.4601,0.9670±0.2123,0.3937±0.0318(P0.05),诱导分化后5d的相对表达量分别为1.634±0.9286,0.8783±0.1702,0.2807±0.0806(P0.05)。同样,在诱导分化后3d和5d检测胞浆内β-catenin相对表达量分别为2.362±1.201,0.8263±0.1096,0.3277±0.1294(P0.05)；2.440±0.8909,1.273±0.0602,0.2700±0.0538 (P0.01)。β-catenin下游的靶基因Ngn1, Ngn2的表达量,ROP18重组腺病毒组(3d为0.8073±0.0700,0.6627±0.1309;5d为0.2213±0.06326,0.3777±0.07826)明显低于分化组(3d为3.848±1.042,1.890±0.3145；5d为1.825±0.6545,1.714±0.3725)和空载体腺病毒组(3d为1.485±0.1259,1.713±0.1396;5d为1.202±0.2765,1.050±0.2177),差异具有统计学意义。双荧光素酶实验检测Wnt信号通路的活性,ROP18重组腺病毒组TOP/FOP值低于分化组和空载体对照组(P0.05)。结论(1)成功构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒,且在C17.2神经干细胞中表达；(2)ROP18重组腺病毒可以诱导C17.2神经干细胞凋亡;(3)ROP18重组腺病毒可以抑制C17.2神经干细胞向神经元的分化；(4)ROP18重组腺病毒可以显著降低Wnt/β-catenin通路中的关键分子β-catenin的表达水平,以及下游靶基因Ngnl和Ngn2的表达,并且可以抑制Wnt信号通路的活性,推测其可能通过此信号通路干预C17.2分化。
【关键词】：弓形虫 棒状体蛋白 ROP18 重组腺病毒 C17.2 神经干细胞 凋亡 分化 Wnt/β-catenin
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 中英文缩略词对照7-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-16
• 2 材料与方法16-31
• 2.1 实验材料16-21
• 2.1.1 实验动物16
• 2.1.2 实验虫株16
• 2.1.3 实验细胞16
• 2.1.4 实验质粒16
• 2.1.5 实验主要试剂16-17
• 2.1.6 实验主要试剂的配置17-20
• 2.1.7 实验主要仪器20-21
• 2.2 实验方法21-31
• 2.2.1 弓形虫在小鼠体内的复苏、传达、收集和冻存21-22
• 2.2.2 C17.2神经干细胞的复苏、传达、冻存22-23
• 2.2.3 ROP18重组腺病毒的构建23-25
• 2.2.4 ROP18重组腺病毒在C17.2神经干细胞上的表达25
• 2.2.5 荧光染色(核染)检测ROP18重组腺病毒转染至C17.2神干细胞上后对细胞的凋亡影响25
• 2.2.6 CCK-8法检测ROP18重组腺病毒转染至C17.2神经干细胞上细胞的增殖活力25-26
• 2.2.7 流式细胞术检测ROP18重组腺病毒转染至C17.2神干细胞上后对细胞的凋亡影响26-28
• 2.2.8 免疫印迹法检测ROP18重组腺病毒对C17.2神经干细中凋亡蛋白表达的影响28-29
• 2.2.9 免疫印迹法检测C17.2神经干胞分化中βⅢ-tubulin蛋白及Wnt信号通路中相关蛋白的表达29-30
• 2.2.10 双荧光素酶实验（Luciferase）检测Wnt信号通路活性30
• 2.2.11 统计学分析30-31
• 3 结果31-41
• 3.1 pHBAd-MCMV-GFP-ROP18重组腺病毒载体的构建31-32
• 3.2 ROP18重组腺病毒在C17.2神经干细胞上的表达32-33
• 3.3 ROP18重组腺病毒对C17.2神经干细胞起增殖抑制作用33-34
• 3.4 ROP18重组腺病毒对C17.2神经干细胞起促凋亡作用34-36
• 3.5 ROP18重组腺病毒抑制C17.2神经干细胞分化36-41
• 3.5.1 ROP18重组腺病毒抑制神经元特异性标志蛋白βⅢ-tubulin的表达36-38
• 3.5.2 ROP18重组腺病毒抑制Wnt信号通路活性38-41
• 4 讨论41-43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-47
• 附一 个人简历47-48
• 附二 致谢48-49
• 附三 综述49-58
• 参考文献54-58

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