抗TRPC3多肽单克隆抗体制备及其初步应用

发布时间：2017-10-16 00:07

  本文关键词：抗TRPC3多肽单克隆抗体制备及其初步应用

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【摘要】：1研究目的与意义瞬时受体电位阳离子通道3亚型(Transient receptor potential channel 3,TRPC3)是一种非选择性、非电压控制的阳离子通道,其主要功能是调控Ca2+、Na+等进出细胞,以维持细胞内环境的稳态。本实验主要目的是制备抗TRPC3多肽单克隆抗体(Monoclonal antibody,Mc Ab),并初步建立双抗体夹心ELISA检测法拟对TRPC3分子表达进行应用。研究意义在于所制备的抗TRPC3多肽单克隆抗体国内外未见销售,且这个单克隆抗体能广泛应用于免疫标记技术,可用于各种TRPC3蛋白表达的相关研究。采用已建立的检测方法可以测定与TRPC3蛋白相关疾病如动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)、高血压等疾病的辅助诊断。2研究的主要内容、方法和结果2.1 TRPC3多肽抗原的设计与合成利用生物信息学方法分析TRPC3的跨膜结构、胞外区域,获得三段线性胞外序列391-418、473-523以及589-637,再根据B细胞抗原表位筛选原则,筛选出TRPC3分子的优势表位肽段509YFTYARDKWLPSDPQ 523。该段序列由15个氨基酸组成,其在抗原指数、亲水性、柔韧性及二级结构分析上均相对其他肽段好。合成的多肽纯度98%,在与钥孔嘁蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联后,作为免疫小鼠的免疫原。2.2制备抗TRPC3多肽单克隆抗体用制备的多肽抗原免疫Balb/c小鼠,三次免疫后,测定小鼠血清免疫效价。1号小鼠血清效价最高,达1:2×104,对1号小鼠加强免疫后可取脾脏细胞进行下一步融合。用聚乙二醇使小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用HAT、HT培养基筛选杂交瘤细胞。利用间接ELISA检测克隆生长孔上清液的抗体,筛选阳性细胞克隆。经过四次有限稀释克隆化后,得到八株100%分泌抗TRPC3多肽抗体的阳性杂交瘤细胞,分别为A5、B8、B10、C6、F6、G11、H7和H9。在此基础上反复检测,最终获得三株稳定分泌抗TRPC3多肽抗体的阳性杂交瘤细胞,分别命名为T1、T2、T3。三株小鼠腹水液超滤浓缩后浓度T1为1.884mg/ml,T2为1.787mg/ml,T3为1.648mg/ml。经SDS-PAGE凝胶电泳分析,三株超滤浓缩后的腹水液在55KD和25KD处均有清晰条带,分别是单克隆抗体的重链与轻链。2.3双抗体夹心ELISA法建立及在临床检测的应用由相对亲和力实验测定,T1抗体的相对亲和力最高,为8.255×10-3μg/ml。采用竞争ELISA实验鉴定单抗的敏感性,T1的IC50为10μg/ml,T2的IC50为1.3μg/ml,T3的IC50为2.6μg/ml,敏感度从高到低依次为:T2T3T1,T2的敏感度最高。在相对亲和力测定基础上,进行配对实验,获得T3+T1配对组合为最佳配对方案,当包被抗体T3的浓度为0.842μg/ml,配对抗体T1的浓度为0.235μg/ml时为其最佳工作浓度。建立的双抗夹心ELISA法的敏感范围为0.681-8μg/ml,灵敏度为0.681μg/ml。采用所建立的双抗体ELISA测定体系对AS相关疾病的血清样本进行TRPC3含量检测,初步证实各病人组高于正常人的值。3结论3.1在确定TRPC3分子的胞外五段序列基础上,通过比对同源性、不同序列的抗原指数、亲水性、柔韧性、二级结构等性质的分析,最终决定将509YFTYARDKWLPSDPQ523氨基酸序列作为TRPC3多肽抗原的合成序列,合成TRPC3多肽纯度大于98%,合成的多肽抗原与KLH偶联后可作为免疫小鼠的免疫抗原。3.2小鼠免疫后,获得了抗TRPC3多肽多克隆抗体,多抗效价为1:2×104;经过细胞融合、筛选和超滤浓缩等过程,建立了T1、T2、T3三株杂交瘤细胞系,获得了抗TRPC3多肽单克隆抗体,其效价为1:8×104,为单抗的应用提供物质基础。3.3通过相对亲和力及抗原表位分析,确定了包被T3+T1抗体,作为最佳配对方案。当包被抗体T3的浓度为0.842μg/ml,配对抗体T1的浓度为0.235μg/ml时为配对抗体的最佳工作浓度,并初步建立了的双抗体夹心ELISA体系,运用到临床样本的检测当中。
【关键词】：TRPC3 多肽 单克隆抗体 ELISA 应用
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 引言8-9
• 第一部分 研究背景和立题依据9-18
• 研究背景 TRPC3在疾病中作用的研究进展9-15
• 1 TRPC3分子简介9-11
• 2 TRPC3与疾病11-12
• 3 展望12
• 参考文献12-15
• 立题依据与研究内容15-18
• 1 立题依据15-16
• 2 研究内容16-17
• 3 技术路线17-18
• 第二部分 实验研究18-60
• 第一章 TRPC3多肽B细胞抗原表位筛选18-27
• 1 材料与方法18-19
• 2 结果19-24
• 3 讨论24-25
• 参考文献25-27
• 第二章 抗TRPC3多肽单克隆抗体制备与鉴定27-49
• 第一节 TRPC3多肽小鼠免疫及血清检测27-32
• 第二节 细胞融合、筛选及建立杂交瘤细胞株32-40
• 第三节 单克隆抗体的扩大化制备、浓缩和鉴定40-48
• 参考文献48-49
• 第三章 双抗体夹心ELISA体系的建立及其在临床检测中的应用49-60
• 第一节 单克隆抗体相对亲和力测定49-53
• 第二节 双抗体夹心ELISA法的建立及其在临床检测中的应用53-59
• 参考文献59-60
• 结论与展望60-61
• 附录 英文缩写61-62
• 硕士期间研究成果62-63
• 致谢63

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本文编号：1039470