结核分枝杆菌新人T细胞表位及特异性蛋白的抗原性研究

发布时间：2017-10-16 08:32

  本文关键词：结核分枝杆菌新人T细胞表位及特异性蛋白的抗原性研究

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【摘要】：结核病(tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引发的严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病。近些年来,由于耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的流行及MTB与人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)共同感染等原因,古老的结核病再次成为全球面临的严峻的公共卫生挑战之一。然而,目前诊断结核病的金标准依然是罗氏固体培养,尚无有效、快速诊断结核病的方法。同时,研究已证实BCG的保护效果不理想,特别是对成年人结核几乎无预防效果。结核分枝杆菌特异性蛋白及其抗原表位的研究,在开发结核病新型诊断方法和研究有效的结核病新疫苗中具有着重要的作用。本研究采用两种方法开展了结核分枝杆菌特异性抗原及人T细胞表位的研究,以期发现最佳的新T细胞抗原,为后续诊断试剂和疫苗研究提供基础。一方面采用生物信息学方法,排除PE/PPE家族蛋白、转座子及已知抗原表位,对余下的所有蛋白进行系统、全面的人T细胞表位预测,并从中筛选优势表位进行生物合成。合成的表位,采用酶联免疫反应斑点法(ELISPOT)进行初步及扩大样本量两步验证。同时对表位集中的预测抗原及已知表位信息的特异性抗原,根据其编码基因序列设计引物,分子克隆方法获得重组质粒后,转化入原核表达系统进行表达,经Ni亲和柱亲和层析方法纯化,得到各重组蛋白。若重组蛋白为包涵体表达形式,采用透析复性以恢复天然构象。最后,建立最佳血清及抗原浓度的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,初步评价重组蛋白的抗原性。利用TEPredict和IEDB两个软件同时预测出了273个抗原蛋白的2726个表位,从中筛选出评分大于5的50个表位,主要分布于Rv1798、Rv0197、Rv0658c、Rv2942及Rv3239c 5个抗原。经进一步表位优化,获取分布于5个抗原上的32条多肽,由生物公司合成并纯化。采集结核病人血,分离得到外周血单个核细胞(PBMC),ELISPOT方法进行初步筛选。经10个细菌学阳性病人血样本对每条多肽的筛选,获得6条阳性多肽。对于阳性肽再使用50个细菌学阳性的结核病人及60个肺部病人和60个健康人作为对照进行验证。单条肽Rv1798-1、Rv1798-2、Rv0197、Rv0658c、Rv2942、Rv3239c的灵敏度分别为12.0%、18.0%、20.0%、8.0%、10.0%、4.0%,特异度均在99%以上。抗原Rv1798两条多肽联合灵敏度为24.0%,而特异度达到100%。由此可见,多肽联合用于结核病的诊断价值,远远高于单条多肽。同时,我们选择了10个特异性蛋白抗原进行分子克隆及原核表达。本研究成功构建了相应抗原的重组质粒,表达纯化得到Gro ES、Lpq H、Pst S3、PPE18、PPE19、Gln A1、Plc A和Ecc A5 8种重组蛋白(其中两个重组质粒未表达成功)。进一步采用ELISA方法评价了这些蛋白在血清学中的诊断价值。抗原Gro ES、PPE18、PPE19、Gln A1及Ecc A5的诊断价值较高,曲线下面积(AUC)大于80%,其中灵敏度分别为72.1%、76.8%、59.0%、66.8%、66.8%,特异度分别为81.4%、78.4%、92.2%、78.4%、83.3%。抗原Lpq H、Pst S3和Plc A的AUC也均大于70%,其灵敏度分别为66.3%、52.1%、75.3%,特异度分别为68.6%、88.2%、65.7%。综上所述,本研究首次采用TEPredict和IEDB两个软件同时对结核分枝杆菌毒力相关抗原进行系统全面的人T细胞表位预测,验证出6条结核分枝杆菌人T细胞表位多肽。同时通过分子克隆表达纯化和血清学验证,获得Gro ES、Lpq H、Pst S3、PPE18、PPE19、Gln A1、Plc A和Ecc A5 8个具有较好的抗原性蛋白,有望成为结核感染免疫诊断和新疫苗研究的候选者。
【关键词】：结核分枝杆菌 人T细胞表位 酶联免疫斑点试验 特异性抗原 酶联免疫吸附试验
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 绪论15-19
• 第2章 T细胞表位预测、合成及验证19-33
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 主要试剂与材料19
• 2.1.2 主要的仪器设备19-20
• 2.1.3 T-SPOT所用全血来源20
• 2.2 方法20-24
• 2.2.1 T细胞表位预测20-21
• 2.2.2 T细胞表位合成21
• 2.2.3 ELISPOT酶联反应斑点法检测21-23
• 2.2.4 统计学处理23-24
• 2.3 结果24-28
• 2.3.1 表位预测24
• 2.3.2 表位合成24-25
• 2.3.3 表位验证25-28
• 2.4 讨论28-33
• 第3章 十种特异性蛋白克隆表达、纯化及鉴定33-65
• 3.1 实验材料33-39
• 3.1.1 菌株、载体33-34
• 3.1.2 主要试剂材料34-35
• 3.1.3 主要溶液及配制35-38
• 3.1.4 主要仪器设备38-39
• 3.2 方法39-48
• 3.2.1 目的基因选择39
• 3.2.2 重组质粒构建39-44
• 3.2.3 重组质粒的表达、纯化、复性及浓度测定44-46
• 3.2.4 ELISA体液免疫初步检测46-48
• 3.3 结果48-61
• 3.3.1 蛋白抗原编码基因中的人T/B细胞表位分布信息48-49
• 3.3.2 十个蛋白的克隆、表达、纯化及浓度测定49-59
• 3.3.3 ELISA法检测血清中Ig G水平59-61
• 3.4 讨论61-65
• 第4章 结论65-67
• 参考文献67-71
• 文献综述 T细胞表位研究及结核分枝杆菌人T细胞表位研究进展71-85
• 参考文献79-85
• 作者攻读学位期间的科研成果85-87
• 致谢87

【参考文献】

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1 陈红丹;林献丹;李万仓;刘丽琳;黄秀敏;夏彬彬;;新生儿乙肝疫苗与卡介苗接种情况分析[J];浙江预防医学;2014年12期

2 施雯慧;成诗明;陈伟;;结核潜伏性感染诊断研究进展[J];疾病监测;2012年03期

3 张中旺;张永光;;抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展[J];微生物学通报;2008年08期

4 蔡学敏;左大明;赵娜;张丽芸;陈政良;;人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2007年01期

5 高文涛,徐泽宽,苗毅;人MUC4氨基酸序列片段CDT_8~+细胞表位的多参数预测[J];南京医科大学学报(自然科学版);2004年06期

6 董海龙,隋延仿,叶菁,李增山,曲萍,张秀敏,陈广生,禄韶英;肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测及合成鉴定[J];中华医学杂志;2003年12期

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本文编号：1041712