EB病毒对WIF1基因甲基化和表达影响的研究

发布时间：2017-10-20 13:00

  本文关键词：EB病毒对WIF1基因甲基化和表达影响的研究

  更多相关文章： Wnt通路抑制因子1 EB病毒 微小RNA 甲基化 胃癌

【摘要】：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)为嗜淋巴细胞病毒属的DNA肿瘤病毒,EBV感染与部分胃癌发生的关系已经确认,EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC)约占胃癌总数的10%。EBVaGC发生的表观遗传学机制的研究主要涉及EBV感染对抑癌基因启动子区甲基化的影响,以及EBV非编码RNA对宿主基因表达调控作用两个方面。目的明确EBV感染对Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor-1,WIF1)编码基因启动子区甲基化以及EBV编码miRNA BART19-3p对WIF1表达的影响,为进一步探讨EBV抑制WIF1表达,进而异常激活Wnt原癌基因通路参与EBVaGC发生发展的作用机制提供实验基础。方法选取2种EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和3种EBV阴性胃癌细胞系HGC-27、MKN-45、SGC7901作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,real time qPCR)检测上述细胞系WIF1表达水平,亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisufite genomic sequencing,BGS)检测WIF1基因启动子区甲基化状态。并分别采用5-Aza-CdR、BART19-3p模拟物以及抑制物作用EBV阳性胃癌细胞系GT38和EBV阴性胃癌细胞系HGC-27,检测药物作用前后2种细胞系WIF1和β-catentin表达水平的变化以及细胞增殖情况。结果①BGS检测结果结果显示,5种胃癌细胞系WIF1启动子区均呈高甲基化状态,甲基化率均在85%以上。②real time qPCR结果显示,胃癌细胞系中WIF1表达普遍下调,以EBV阳性细胞系GT38和GT39下降更为明显;5-Aza-CdR作用后GT38和HGC-27两种细胞系WIF1表达均上调,其中HGC-27上调更为显著;同时,Western Blot显示两种细胞系β-catenin水平均下调。③EBV阴性细胞系HGC-27转染外源性BART19-3p模拟物后,WIF1表达进一步下调,β-catenin水平升高,细胞增殖率增加。④EBV阳性细胞GT38转染外源性BART19-3p抑制物后,WIF1表达水平升高,β-catenin表达水平下调,细胞生长抑制率增加。结论①EBV阴性和阳性细胞系中WIF1表达水平均较低,EBV阳性细胞系中表达缺失或下调情况更为明显,去甲基化试剂5-Aza-CdR处理可不同程度上调GT38及HGC-27细胞系WIF1表达,EBV阴性细胞系HGC-27上调更为明显。②外源性BART19-3p模拟物转染EBV阴性细胞系HGC-27可进一步抑制WIF1表达,抑制β-Catenin降解,促进其积聚。提示BART19-3p可拮抗WIF1对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用,进而在EBV相关肿瘤的发生发展中发挥作用。③外源性BART19-3p抑制物转染EBV阳性细胞系GT38可抑制EBV编码的BART19-3p的作用,WIF1表达上调,从而抑制β-catenin的积聚,进一步证明BART19-3p对WIF1的抑制作用。④尽管普遍认为EBV对宿主表观遗传学的影响主要为抑癌基因启动子区甲基化,但就WIF1而言,其编码miRNAs可能发挥主要作用。
【关键词】：Wnt通路抑制因子1 EB病毒 微小RNA 甲基化 胃癌
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 第一章 材料与方法11-21
• 1.1 仪器、试剂和耗材11-12
• 1.1.1 主要仪器11
• 1.1.2 主要试剂和耗材11-12
• 1.2 核酸提取12-14
• 1.2.1 细胞系DNA提取12-13
• 1.2.2 细胞系RNA提取13
• 1.2.3 总RNA纯化13-14
• 1.3 细胞的处理14-15
• 1.3.1 实验前准备14
• 1.3.2 首次传代前细胞的复苏14
• 1.3.3 培养液的更换14
• 1.3.4 细胞传代14-15
• 1.3.5 5-Aza-CdR作用15
• 1.3.6 miRNAs转染15
• 1.4 DNA样本亚硫酸盐处理15-16
• 1.4.1 DNA前处理16
• 1.4.2 亚硫酸盐修饰及纯化16
• 1.4.3 修饰后处理16
• 1.5 WIF1甲基化状态检测16-17
• 1.5.1 甲基化特异性PCR (MSP)16-17
• 1.5.2 亚硫酸盐基因测序17
• 1.6 WIF1 mRNA检测17-18
• 1.6.1 RT-PCR17-18
• 1.6.2 实时荧光定量PCR18
• 1.6.3 Real-time qPCR结果数据分析18
• 1.7 MTT法检测细胞增殖活性18-19
• 1.8 琼脂糖凝胶电泳19
• 1.8.1 凝胶制备19
• 1.8.2 电泳19
• 1.8.3 显色19
• 1.9 Western Blot检测目的基因的表达19-21
• 第二章 结果21-29
• 2.1 胃癌细胞系WIF1启动子甲基化状态BGS检测结果21
• 2.2 WIF1在胃癌细胞系中的表达21-22
• 2.3 5-Aza-CdR对WIF1基因甲基化状态的影响22
• 2.4 5-Aza-CdR对WIF1基因转录表达的影响22-23
• 2.5 BART19-3p模拟物和抑制物对WIF1转录表达的影响23
• 2.6 5-Aza-CdR对细胞增殖的影响23-25
• 2.7 BART19-3p模拟物对细胞增殖的影响25-26
• 2.8 BART19-3p抑制物对细胞增殖的影响26-27
• 2.9 5-Aza-CdR对 β-catenin表达水平的影响27
• 2.10 BART19-3p模拟物和抑制物对 β-catenin表达的影响27-29
• 第三章 讨论29-32
• 结论32-33
• 参考文献33-36
• 综述36-52
• 综述参考文献47-52
• 攻读学位期间的研究成果52-53
• 致谢53-54

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