小鼠活体内泡状棘球蚴荧光成像模型建立方法的探讨

发布时间：2017-11-01 02:16

  本文关键词：小鼠活体内泡状棘球蚴荧光成像模型建立方法的探讨

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【摘要】：背景:肝泡状球蚴病作为一种重要的人畜共患寄生虫病威胁着北半球广大牧区居民的生命安生。现有的治疗肝泡球蚴病的药物如阿苯达唑等往往对泡球蚴只能起到抑制作用,而对其的杀灭作用有限,对于少数病例甚至无效,且停药后复发率较高,因此有必要进一步寻找更佳的抗肝泡球蚴病的药物。以往的肝泡球蚴药敏实验模型主要依靠计算囊湿重、免疫组织化学染色等病理解剖学手段观察病灶对药物的反应情况,不仅操作繁琐、费时费力且无法对同一实验动物进行纵向监测。近十年来,活体内荧光成像技术的不断发展使活体内动态观察肿瘤、感染等病灶成为了可能。目的:建立一种活体小鼠体内泡状棘球蚴原头节荧光成像模型,为今后的泡状棘球蚴病体内实验提供可动态观察的动物模型。方法:从感染泡状棘球蚴的实验室长爪沙鼠体内获得泡球蚴囊泡,分离、研磨并过滤得到泡状棘球蚴原头节,体外培养。分别使用不同浓度的二甲双胍、阿苯达唑及二者联合处理原头蚴,使用台盼蓝外排实验测定头节活性。使用JC-1线粒体膜电位指示剂对三组原头节进行染色,在激光共聚焦显微镜下观察并测定原头节所发射出的红/绿荧光比值以及红、绿荧光各自随时间的变化情况。随后将三组原头节分别种入三组BALB/c小鼠的肝被膜下,使用IVIS Lumina活体小动物成像仪对小鼠进行成像,测定红/绿荧光比值并与体外测定结果进行对比。最后观察自然条件下(不使用抗包虫药物)观测JC-1荧光的衰减情况,绘制曲线。结果:亚甲蓝外排实验测得10 mM二甲双胍处理组原头节活性为27.43%(51/186),低于对照组(96.27%,136/141)、1m M二甲双胍处理组(90.01%,158/175)以及5m M二甲双胍处理组(73.48%,113/153)(P0.05)。15μM阿苯达唑与10 m M二甲双胍与联合使用处理组的原头节活性为4.63%(5/107),低于其与5m M二甲双胍联合处理组(46.30%,82/177)、与1m M二甲双胍联合处理组(69.73%,103/147)及15μM阿苯达唑单独处理组(82.35%,198/240)(P0.05)。激光共聚焦显微镜下可观察到阿苯达唑联合二甲双胍处理组的原头节体内JC-1红绿荧光比值为0.29,低于二甲双胍单独处理组(1.06)及对照组(4.53)(P0.05)。说明联合处理组原头节的线粒体功能较二甲双胍单独处理组和对照组明显减退,与之前的亚甲蓝外排实验结果相一致,提示二甲双胍是通过抑制原头节的线粒体功能进而导致能量代谢障碍起到抗泡球蚴作用的。在体外分别对上述三组原头节的红、绿荧光作动态观察记录,结果显示联合治疗组的红色荧光的衰减速度明显快于二甲双胍单独治疗组及对照组。到48小时后,三组红色荧光之间无明显差异,提示此时红色荧光的衰减已经影响到原头节活性监测的准确性。绿色荧光方面,二甲双胍处理组的绿色荧光在24h、36h和48h均明显强于未处理组(P0.01),联合处理组的绿色荧光24h和36h明显强于二甲双胍处理组。将三组原头节分别注射入小鼠的肝被膜下,进行活体内荧光成像。测得二甲双胍处理组原头节的红绿荧光比值明显低于未处理组原头节(P0.01),而联合处理组原头节的红绿荧光比值又明显低于二甲双胍处理组(P0.01)。这与之前体外激光共聚焦测得的结果相吻合,说明使用JC-1作为标记物可以较好地进行泡球蚴活体内荧光成像,且病灶部位红绿荧光比值可以较为准确地反映此处泡球蚴原头节的活性。对注射了未处理组原头节的小鼠进行动态荧光成像监测,结果示红色荧光的衰减略快于绿色荧光,可能与非结合态的JC-1的抗荧光漂白能力强于结合态JC-1有关。结论:JC-1可以作为泡球蚴原头蚴小鼠活体内荧光成像的标记物,对小鼠体内的泡球蚴原头节进行部位及活性的监测,经过较为合理的光谱分离算法优化后无明显背景噪音,有效监测时间约为36h。体内实时荧光成像有望成为监测泡状棘球蚴小鼠模型的新手段,为将来新型抗包虫药物的体内高通量药敏实验创造条件。
【关键词】：荧光成像 活体内 泡状棘球蚴病 模型
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.32;R-332
【目录】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-19
• 1.1 实验所需的动物材料与分组方式14
• 1.2 试剂与药品14
• 1.3 主要仪器设备14-15
• 1.4 主要试剂的配制15-16
• 1.5 泡球蚴原头节的获取与体外培养16
• 1.6 泡球蚴原头节亚甲蓝外排活性测定实验16
• 1.7 JC-1 染色步骤16-17
• 1.8 技术路线图17-18
• 1.9 激光共聚焦显微镜测定原头节的荧光强度18
• 1.10 泡球蚴小鼠模型的建立18
• 1.11 泡球蚴小鼠模型的观察与分析18
• 1.12 统计学分析18-19
• 结果19-26
• 1.1 二甲双胍可以使泡球蚴原头节的活性减弱19-20
• 1.2 线粒体膜电位水平可以反映泡球蚴原头节的活性，二甲双胍可以通过抑制线粒体功能降低泡球蚴原头节的活性20-23
• 1.3 JC-1 可以作为荧光标记物用于建立泡球蚴原头节的小鼠活体内成像23-26
• 讨论26-27
• 结论27-28
• 参考文献28-31
• 综述31-38
• 参考文献35-38
• 致谢38-39
• 作者简介39-40
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表40

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本文编号：1124802