含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

发布时间：2017-11-02 15:01

  本文关键词：含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

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【摘要】：目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达。转染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。
【作者单位】： 中南大学湘雅医学院微生物学系;
【关键词】： 丙型肝炎病毒 复制子 绿色荧光蛋白 基因表达
【基金】：湖南省科技计划项目(No.2013SK3069,2014SK3248)
【分类号】：R373.21
【正文快照】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是丙型肝炎的病原体,感染慢性化程度高,并可发展为肝硬化和肝细胞癌。目前治疗手段局限,也无预防性疫苗[1]。1999年Lohmann等[2]成功建立了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统,该复制子能在人肝癌细胞系Huh-7中高水平自主复制,这被

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本文编号：1132026