核蛋白PCNP对小鼠DC细胞迁移与增殖能力的影响
发布时间：2017-11-02 15:21
本文关键词：核蛋白PCNP对小鼠DC细胞迁移与增殖能力的影响
更多相关文章： PCNP DC细胞 MG-132 LPS 克隆形成能力
【摘要】：背景PCNP(PEST-Containing Nuclear Protein)是于2002年新发现的一种含有PEST序列的核蛋白,它是泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING Figer Protein)的底物。NIRF包含类泛素化区域(a ubiquitin-like domain),YDG/SRA区域(a YDG/SRA domain),PHD区域(a PHD domain)和指环状区域(a RING domain)等四个区域,研究发现NIRF在正常细胞增殖期间呈现高表达,而在G0/G1期间呈现低表达。核蛋白PCNP包含的PEST序列中含有丰富的脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T),是短寿命蛋白。而含有PEST序列的功能蛋白质通常是通过水解途径调控,且大多数是通过泛素介导途径降解。NIRF本身具有泛素连接酶的特征,且其自身具有自动泛素酶的活性。泛素依赖性蛋白的降解可以调节依靠泛素化途径的多种细胞周期的过程,目前研究证实,这些过程包括细胞的周期进程、蛋白质的运输、DNA的损伤和变异。NIRF泛素连接酶与被降解蛋白质的特异性底物PCNP结合,进而影响泛素化反应的功能与效率。例如核蛋白PCNP在293T细胞和COS-7细胞中是很容易被泛素化,在体内或体外NIRF都能够把PCNP泛素化。这说明NIRF与PCNP信号轴可能通过对细胞周期的调控而对细胞增殖发挥一定的调节作用。同时研究表明,在很多肿瘤细胞基因中NIRF在9p23-24.1段基因出现的频繁明显高于正常细胞,推测PCNP和NIRF可能也与肿瘤发生有一定的关系。树突状细胞(Dendritic Cells DC)是目前确定的唯一能激活初始T细胞的专职抗原递呈细胞,能高效地摄取加工、处理、递呈抗原,DC数量极少,仅占单核细胞的1%,未成熟迁移能力强。微量的LPS就能刺激DC合成与释放细胞因子(TNF-α)。本课题组前期研究发现,小鼠脾脏中CD8α+DC细胞中PCNP的m RNA水平高表达。前期结果显示沉默PCNP能抑制DC增殖。目前在DC细胞中对PCNP的研究尚未报道。本课题初步探讨了核蛋白PCNP在DCs中的作用及其分子机制。目的1、探索PCNP过表达和沉默对DC细胞生物学功能的影响。2、探讨LPS和蛋白酶体抑制剂“MG-132”对PCNP过表达和沉默后的DC细胞生物学功能的影响。方法1、DC2.4细胞对照(未处理)组:用流式细胞仪,检测DC-PCNP-Flag、DC-sh-PCNP及其相应对照组稳定株的表面分子MHC II及共刺激分子CD80、CD86的表达。用Transwell小室和细胞划痕实验,研究PCNP过表达与沉默后对DC细胞迁移的影响。用平板克隆实验,研究PCNP沉默和过表达后对DC细胞克隆形成能力的影响。2、实验组:在DC2.4细胞中分别加入LPS和蛋白酶体抑制剂(MG-132);检测对DC细胞形态、迁移、克隆形成能力的影响。结果1、成功建立PCNP-Flag及PCNP-EGFP过表达稳定株。2、成功筛选得到过表达稳定株DC-Flag(对照组)、DC-PCNP-Flag、DC-EGFP(对照组)、DC-PCNP-EGFP;沉默稳定株DC-RNAi-NC(Negative Control NC)和DC-sh-PCNP稳定株。3、DC-PCNP-Flag稳定株与对照组相比,细胞形态无明显变化;DC-sh-PCNP稳定株与对照组相比,细胞形态也无明显变化。4、经流式检测,DC-PCNP-Flag稳定株与对照组相比,其表面分子MHC II和共刺激分子CD80、CD86的表达量均无统计学意义;而DC-sh-PCNP稳定株与对照组相比,其表面共刺激分子CD80、CD86的表达量也均无统计学意义;其各自的表面分子MHC II均无明显变化。5、经细胞迁移实验(细胞划痕和Transwell小室实验)发现PCNP过表达组(DC-PCNP-Flag)DC2.4稳定株与对照组细胞相比,其迁移能力下降(P㩳0.05),而PCNP沉默组(DC-sh-PCNP)稳定株与对照组相比,其迁移能力增强(P㩳0.01)。6、平板克隆实验,证明PCNP沉默后在DC细胞中抑制克隆形成能力(P㩳0.05),而PCNP过表达后能促进DC细胞的克隆形成能力(P㩳0.01)。7、加入LPS后,DC细胞PCNP的沉默组与过表达组均促进DC的迁移能力,而两组间相比无差异(P㧐0.05);加入MG-132后,DC细胞PCNP的沉默组与过表达组均抑制DC的迁移能力,而两组间相比也无差异(P㧐0.05);而LPS和MG-132对DC细胞的迁移能力的作用相反(P㩳0.01)。8、加入LPS后,DC细胞PCNP的沉默组与过表达组均促进DC的克隆形成能力,而两组间相比无差异(P㧐0.05);加入MG-132后,在DC细胞PCNP沉默组与过表达组均抑制DC的克隆形成能力,而两组间相比也无差异(P㧐0.05);而LPS和MG-132对DC细胞的克隆形成能力的作用相反(P㩳0.01)。结论1、DC未成熟时(没有LPS刺激时),PCNP对DC2.4细胞的形态、表面分子、均无影响,但能够抑制DC2.4细胞的迁移能力,提高DC2.4细胞的克隆形成能力。2、5ug/ML LPS刺激时(DC成熟时)能够提高DC迁移、克隆形成能力,但此时的作用与PCNP无关。3、10ug/ML蛋白酶体抑制剂(MG-132)能抑制DC细胞的迁移和克隆形成能力,反之,LPS则能促进DC细胞的迁移和克隆形成能力,但此时的作用与PCNP无关。
【关键词】：PCNP DC细胞 MG-132 LPS 克隆形成能力
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：
- 摘要4-7
- ABSTRACT7-13
- 缩略词表13-15
- 1 引言15-17
- 2 材料17-25
- 2.1 使用的主要试剂17-19
- 2.1.1 细胞培养相关试剂17
- 2.1.2 蛋白和RNA相关试剂17-18
- 2.1.3 相关抗体18-19
- 2.2 主要仪器设备19-20
- 2.3 主要溶剂的配制和方法20-25
- 3 方法25-35
- 3.1 免疫荧光实验（鉴定DC2.4 细胞）25
- 3.2 引物设计25-26
- 3.3 Ecoli DH5α 感受态细胞的制备26-27
- 3.4 转化27
- 3.5 挑取阳性克隆27-28
- 3.6 PCMV-C-Flag及所用质粒的提取28
- 3.7 质粒的验证28
- 3.8 DC2.4 细胞培养与转染28-29
- 3.9 DC2.4 细胞m RNA的提取及反转录29-30
- 3.10 RT-PCR30-31
- 3.11 DC2.4 细胞蛋白质的提取和浓度测定（BCA法）31
- 3.12 免疫印迹杂交法31-33
- 3.13 流式细胞术对DC2.4 细胞膜表面表达分子及表面共刺激的分子的检测（直接标记法）33
- 3.14 DC2.4 细胞划痕实验33
- 3.15 DC2.4 细胞小室实验33-34
- 3.16 DC2.4 细胞平板克隆实验34
- 3.17 统计学分析34-35
- 4 结果35-51
- 4.1 DC2.4 细胞鉴定35-37
- 4.2 PCNP片断和CDS区全长37-38
- 4.3 成功建立PCNP过表达及沉默稳定株（RT-PCR验证）38
- 4.4 成功构建PCNP过表达及沉默稳定株（Western Blot验证）38-40
- 4.5 PCNP过表达与沉默对DC2.4 细胞形态的影响40-41
- 4.6 PCNP 过表达与沉默对 DC 表面分子 MHCII 及表面共刺激分子CD80、CD86 的影响41-42
- 4.7 PCNP过表达与沉默对DC细胞迁移的影响（细胞划痕实验）42-43
- 4.8 PCNP过表达与沉默对DC细胞迁移的影响（T实验）43-44
- 4.9 PCNP过表达与沉默对DC细胞克隆形成能力的影响（平板克隆实验）44-45
- 4.10 分别用LPS和MG-132 处理DC2.4 细胞的PCNP基因沉默和过表达稳定株，，检测处理后DC2.4 细胞形态的变化45-46
- 4.11 PCNP沉默和过表达后的DC2.4 细胞再分别用LPS和MG-132 处理，检测对DC细胞迁移的影响46-47
- 4.12 DC2.4 细胞经PCNP沉默和过表达后分别用LPS和MG-132 处理，观察对DC细胞克隆形成能力的影响47-49
- 4.13 PCNP 沉默和过表达后再分别用 LPS 和 MG-132 处理对 DC2.4细胞 TNF-α 表达的影响49-51
- 小结51-53
- 讨论53-59
- 结论59-61
- 参考文献61-65
- 综述65-87
- 参考文献82-87
- 致谢87-89
- 在读期间参加的学术会议及研究成果89-90
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 高倬,孟凡虹;野荞根素对四种人癌细胞克隆形成能力的影响[J];中国中药杂志;1993年08期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 郑小丽;核蛋白PCNP对小鼠DC细胞迁移与增殖能力的影响[D];河南大学;2016年
本文编号：1132096
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/binglixuelunwen/1132096.html
最近更新
教材专著
