抗人神经菌毛素1 b1b2区单克隆抗体的制备及其单链抗体原核表达菌的制备

发布时间：2017-11-08 09:04

  本文关键词：抗人神经菌毛素1 b1b2区单克隆抗体的制备及其单链抗体原核表达菌的制备

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【摘要】：神经菌毛素-1 (Neuropilin-1; NRP1)是一种多功能的非酪氨酸激酶受体,可结合III类神经轴突导向因子(SEMA 3)介导神经系统的发育,同时,通过与血管内皮生长因子(VEGF)结合调节血管的生成,尤其是在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用。NRP1由胞外区、跨膜区、胞内区组成,目前发现其胞外区的功能更为重要,胞外区分为a1a2、b1b2、c结构域,VEGF165主要通过与NRP1胞外区blb2结构域结合发挥作用。因此,本课题组通过基因工程技术克隆得到人NRP1 b1b2 (HuNRP1b1b2)结构域cDNA并表达其重组蛋白,通过杂交瘤技术获得特异性针对HuNRP-1b1b2单克隆抗体(McAbs)并初步分析其生物学功能发现其可以与天然NRP1结合并且能够抑制内皮细胞的迁移以及脐静脉内皮细胞的体外成管。选择有生物学活性的杂交瘤细胞株通过基因工程技术提取mAb的重链及轻链编码基因,构建含抗人神经菌毛素单链抗体(single chain Fragment variable, ScFv)编码基因的重组载体并进行原核表达。目的：构建抗HuNRP1b1b2单克隆抗体并研究其生物学活性,制备单链抗体原核表达菌,为进一步研究HuNRP1b1b2生物学的功能提供生物材料。方法：①克隆HuNRP1b1b2区的编码基因并对其进行蛋白表达；②制备抗HuNRP-1b1b2的mAb并分析其生物学特性；③提取阳性杂交瘤细胞株的总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)方法获取抗HuNRP1b1b2重链可变区(Heavy Variable, VH)及轻链可变区(Light Variable,VL)的基因序列；④用重叠PCR (overlap-PCR)方法获取抗HuNRP1b1b2 ScFV序列；⑤通过双酶切及定向克隆技术把ScFV克隆到噬菌粒pCANTAB5E载体,构建重组质粒pCANTAB5E-ScFV;⑥将重组的质粒转化入大肠杆菌TG1菌。结果：①获得人神经菌毛素1的blb2区蛋白,大小约34 kDa。②获得稳定分泌抗HuNRP1b1b2 McAbs细胞株,命名为6A2与1A10。③单克隆抗体能够识别天然NRP1,可有效抑制HUVEC的迁移并对HUVEC的体外成管能力具有一定的抑制作用。④通过噬菌体表面展示技术,初步获得HuNRP1b1b2单链抗体。结论：获得HuNRP1b1b2单克隆抗体,且单克隆抗体具有与天然NRP1的结合能力,并且能够抑制脐静脉内皮细胞的体外成管。通过噬菌体表面展示技术,初步获得HuNRP1b1b2单链抗体,为进一步研究HuNRP1的生物学功能垫下基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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本文编号：1156471