子宫内膜巨噬细胞对血管内皮生长因子A的表达及胚胎着床的影响

发布时间：2017-11-24 20:31

  本文关键词：子宫内膜巨噬细胞对血管内皮生长因子A的表达及胚胎着床的影响

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【摘要】：研究背景胚胎着床是妊娠过程的主要限制步骤,也是胚胎发育伊始最重要的一个环节。胚胎着床是一个非常复杂而精密调控的母胎对话过程：一方面从卵母细胞透明带消失,到分化出合体滋养细胞,胚胎需要正常的发育；另一方面孕妇体内有足够数量的孕酮,在激素的刺激下,在人类通常为排卵后7天,子宫有一极短敏感期称为着床窗,允许胚胎着床。只有两方面同步发育且功能协调,胚泡经过转运、定位、黏附、和穿入,才能最终成功着床。在任一步骤发生异常,都可能导致着床失败。对子宫内膜组织学研究显示,局部血管生成处于高峰状态是围着床期子宫内膜最明显的标志之一,这种血管生成微环境的功能正常是胚胎着床、胎盘形成和妊娠维持的先决条件。近年来,巨噬细胞(macrophages, Mφ)于着床窗在子宫内膜的聚集和其可能参与着床的机制引起越来越多学者的兴趣。作为机体固有免疫的重要组成细胞,蜕膜巨噬细胞(decidual macrophage, dMcp)具有截然不同的表型,不能被简单归类为促炎M1或抗炎M2型,胚胎的着床造成内膜微环境的炎症状态,蜕膜免疫细胞大量募集,巨噬细胞约占其中20%。对反复着床失败的患者人工诱导无菌性炎症反应,巨噬细胞的明显聚集能促进胚胎着床,增加妊娠率,但其具体机制尚不明确。着床窗小鼠子宫内膜的微血管环境改变是子宫内膜容受性建立的关键。着床后子宫内膜巨噬细胞募集数量与局部血管生成具有相关性增长,均提示巨噬细胞在着床期子宫内膜可能发挥着除介导免疫耐受外更多的作用,例如维持蜕膜血管生成微环境平衡的潜在功能。恶性肿瘤的侵袭和生长在一定程度上与胚胎粘附和着床过程相似,恶性肿瘤的侵袭过程中,巨噬细胞参与了血管生成。当外周循环血中的单核细胞迁移到肿瘤组织后,在肿瘤微环境的作用下分化为肿瘤相关性巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAM)。TAM被发现在维持肿瘤局部毛细血管网的平衡中的重要作用,TAM加速血管的生长增长是通过上调和释放促血管因子而得以实现。这些促血管因子也是肿瘤微环境巨噬细胞向M2极化或M1/M2混合表型的体现。TAM最为主要的促血管因子是血管内皮生长因子A (VEGF-A, or VEGF)。在很多类型的人类癌症中VEGF-A的水平与TAM密度相关。例如乳腺癌中,肿瘤的无血管缺氧区域,TAM能够产生VEGF-A。iNOS即巨噬细胞一氧化氮合成酶,在静止的巨噬细胞中检测不到NOS,但受免疫或炎症刺激激活的巨噬细胞诱导后,会有大量酶的形成,能持续而大量的释放一氧化氮(NO)。TAM的相关研究显示对血管新生的双向调节可能主要是通过对VEGF合成的影响间接实现的,也就是说NO与VEGF共同组成调节血管生成的功能蛋白质复合体,NO扮演着VEGF合成的上游调节因子的角色,这种调节功能与局部NO浓度梯度、氧分压、NO供体等因素紧密相关：低氧环境下少量NO可能通过丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)或p38激酶通路上调VEGF基因的表达,其间可能还有低氧诱导蛋白(HIF).1和血红素氧化酶(HO).1的参与；但大量NO抑制VEGF基因的表达通路尚未明了。TAM在肿瘤微环境血管生成中的地位和靶标治疗已成为肿瘤基础研究中的热点问题。我们前期工作中发现,在妊娠小鼠胚胎着床后dMφ、VEGF-A、iNOS的表达强度显著增高,并与新生血管密度存在正相关关系,那么子宫巨噬细胞是否也参与了胚胎着床中蜕膜局部血管微环境的构建,进而参与胚胎着床?这是本课题的研究重点。迄今为止,尚未见到国内外对着床期子宫内膜巨噬细胞进行局部抑制的方法,用以研究其参与胚胎着床的机制。全身敲除巨噬细胞的小鼠存在卵巢血管网破坏、孕酮水平的下降,动情周期紊乱,下丘脑垂体性腺轴的功能受损,这可能是导致模型中胚胎着床失败的主要原因。卵巢的排卵功能及激素分泌功能在妊娠中的重要作用毋庸置疑,全身敲除巨噬细胞的模型不仅影响排卵而且干预了妊娠维持最为重要的孕激素,并不能说明巨噬细胞本身在着床关键期在子宫内膜局部发挥的特定作用,因此为避免卵巢及全身巨噬细胞的影响,我们希望通过建立小鼠着床期子宫局部巨噬细胞抑制模型,用以研究小鼠子宫内膜巨噬细胞对子宫内膜容受性及胚胎着床过程的影响。脂质体是一种人工合成的具有双分子层结构的封闭囊泡。利用能和细胞膜融合的特点,脂质体可作为载体将药物送入细胞内部,以达到靶向目的。水溶状态下的氯膦酸二钠不能跨越脂质体和细胞的磷脂双分子膜,当包裹于脂质体内后,即可被巨噬细胞特异性吞噬,巨噬细胞的膦酯酶破坏脂质体后氯膦酸二钠被释放到胞质内,达到特定浓度即可引起巨噬细胞的凋亡。有学者报道了氯膦酸二钠脂质体(Clodronate Liposomes,CL)局部作用于睾丸、卵巢的实验研究,均能有效剔除局部巨噬细胞。因此,本研究利用巨噬细胞特异性清除剂CL,建立巨噬细胞抑制小鼠模型；并在小鼠的着床关键期抑制子宫内膜局部的巨噬细胞,观察着床点和非着床点中其对VEGFA、iNOS表达影响,及其对胚胎着床的影响。深入研究围着床期子宫内膜血管生成微环境的调节机制,有助于进一步理解子宫内膜容受性的内涵,为探索干预子宫内膜容受性调节的新靶点提供更充分的科学依据,并能为推动着床障碍(反复体外受精.胚胎移植失败和习惯性流产)、不明原因性不孕的促血管生成治疗奠定实验基础,同时也为异常子宫出血、免疫避孕、器官移植研究提供新的思路,对于改善女性生殖能力及治疗不孕不育和复发性流产等相关疾病具有重要意义。目的建立子宫内膜局部抑制巨噬细胞的小鼠模型,观察着床期巨噬细胞抑制对胚胎着床影响,研究小鼠子宫内膜巨噬细胞对VEGFA、iNOS表达的影响,并研究子宫内膜着床位点与非着床位点巨噬细胞、VEGFA、iNOS的分布差异,进一步探讨其在胚胎着床中的作用。方法1)取成熟未育的昆明种小鼠为研究对象,阴道涂片观察细胞组织学变化,确定动情期小鼠。取动情期小鼠30只,随机分为两种注射途径给药,尾静脉注射(n=15)和宫腔内注射(n=15)。小鼠随机分为三组,实验组(n=5),对照组(n=5)和空白组(n=5)。尾静脉组中,实验组从尾静脉缓慢推注包裹有氯膦酸二钠的脂质体混悬液0.1ml/10g,对照组包裹有磷酸缓冲盐的脂质体(PBS liposomes, PL),空白组则注射灭菌PBS。宫腔内注射中,分别用微量注射器,手术直视下由卵巢侧宫角向宫腔内注射包裹有氯膦酸二钠的脂质体混悬液、包裹有PBS脂质体和灭菌PBS各15u1。2)于注射后48h,采用免疫组织化学法、流式细胞学方法检测射氯膦酸二钠脂质体对子宫F4/80+巨噬细胞的抑制效率。择优选取宫腔内注射建立小鼠着床期子宫内膜巨噬细胞抑制模型。3)取D3.5(雌鼠交配后次日晨阴道见栓为D0.5)孕鼠30只,随机分为三组,实验组(n=10)、对照组(n=10)和空白组(n=10)。使用微量注射器从近卵巢侧子宫角部向宫腔内缓慢注入15ul药物。实验组向左侧宫腔内注射CL,右侧注射包裹有PBS脂质体；对照组向双侧宫腔内注射PL；空白组向双侧宫腔内注射等体积灭菌PBS溶液作为空白对照。4)获取D5.5小鼠子宫和卵巢,台盼兰染色显示各单侧子宫的胚胎着床数,HE染色观察着床点组织形态变化。5)采用免疫组化技术检测子宫内膜、卵巢内巨噬细胞数量变化。流式细胞学方法检测子宫F4/80+CD11b+巨噬细胞相对百分比,验证注射CL对着床期子宫巨噬细胞的选择性抑制作用。6)免疫组织化学方法观察着床位点和非着床位点巨噬细胞、VEGFA、iNOS的表达变化。结果1)宫腔内注射后,HE染色显示小鼠子宫组织完整,腺体结构清晰,无炎性细胞浸润。2)在对动情期小鼠进行尾静脉注射、宫腔内注射后48h,免疫组织化学方法检测实验组的子宫内膜巨噬细胞数量与对照组(P0.01)、空白组(P0.01)相比均显著减少。两种方法在子宫内膜巨噬细胞的抑制程度无明显差异(P=0.788)。3)宫腔内注射后48h,实验组的卵巢巨噬细胞数量与对照组、空白组相比无明显差异(P=0.762)。采用尾静脉途径注射脂质体后,对照组、空白组与宫腔内注射结果相似,但实验组卵巢内巨噬细胞却有所下降,差异有统计学意义(P0.01)。尾静脉注射相比宫腔内注射对卵巢巨噬细胞有明显抑制作用(P0.05)。4)流式细胞学检测动情期小鼠尾静脉注射、宫腔内注射后48h,实验组F4/80+巨噬细胞较对照组及空白组均显著下降,差异有统计学意义。5)着床期宫腔内注射CL后,免疫组织化学检测方法检测到着床位点上,实验组左侧注射CL的子宫内膜巨噬细胞数(22.50±=8.15)较PL侧(83.60±12.15)显著降低,较对照组左侧和空白组左侧也显著降低(P0.05),三组的右侧则无明显差异。非着床位点巨噬细胞数变化与之类似。着床位点的巨噬细胞均高于非着床位点,巨噬细胞具有聚集于着床位点的趋势。6)实验组左侧子宫宫腔内注射CL后48h,对小鼠子宫单细胞悬液用流式细胞学方法检测F4/80+CD11b+巨噬细胞相对比例较实验组注射PL侧、对照组和空白组的各侧有显著下降,抑制率为74%。7)着床期宫腔内注射CL后,实验组卵巢的巨噬细胞数量与对照组、空白组相比无明显差异。8)当抑制了着床期间子宫局部的巨噬细胞后,胚胎着床数显著降低,胚胎着床被部分抑制。实验组左侧注射CL后平均胚胎着床数为2.20±1.81个,显著低于实验组右侧注射PL、空白组左侧及对照组左侧,平均着床位点分别：5.10±1.91个,5.00±2.21,5.80±2.25(P0.05),三组右侧无明显差异。9)在实验组注射CL侧仅有的胚胎着床位点,虽可见胚胎结构,但宫腔未闭合,蜕膜化范围较实验组PL侧缩小。PL侧小鼠着床位点上皮细胞明显水肿,间质细胞明显蜕膜化,宫腔闭合。10)在着床位点,随着实验组注射CL侧的子宫巨噬细胞受到抑制,子宫内膜的VEGFA蛋白表达明显低于实验组右侧注射PL(P0.05),非着床点实验组注射CL侧的子宫VEGFA的表达较PL侧虽有所降低,但差异无统计学意义(P=0.069),实验组两侧的VEGFA表达在着床位点的均高于非着床位点(P0.05)。11)实验组注射CL侧和PL侧子宫内膜的iNOS阳性细胞数量无明显差异(P=0.552)。非着床点iNOS的表达在CL侧与PL侧之间无明显差异(p=0.711)。实验组PL侧子宫iNOS阳性细胞数在着床位点的高于非着床位点,差异有统计学意义(P0.05)。而CL侧iNOS阳性细胞数在着床位点虽高于非着床位点,但差异无统计学意义(P=0.118)。结论1)严格遵守无菌操作的宫腔内注射并不影响子宫组织完整性,可作为宫腔内给药的途径。2)利用巨噬细胞特异性清除剂氯膦酸二钠脂质体,通过两种途径：尾静脉注射与宫腔内注射,均能有效抑制小鼠子宫巨噬细胞,而通过宫腔内注射可有效避免对卵巢的影响,且单侧的药物给药可以使得两侧的子宫互为对照,为精确研究子宫内膜巨噬细胞的功能提供良好的动物模型,在国内外为首次报道。3)抑制子宫局部巨噬细胞导致胚胎着床率下降,着床部位蜕膜化不完全,宫腔不能闭合,证明子宫内膜中的巨噬细胞为胚胎着床所必需。4)当着床期抑制子宫内膜巨噬细胞后,着床点VEGFA的表达随巨噬细胞的抑制一致性降低,提示巨噬细胞可能是通过调控VEGFA的表达,参与构建蜕膜局部血管生成微环境,从而影响子宫内膜容受性及胚胎着床。5)子宫的iNOS表达并不随子宫巨噬细胞的抑制而降低,可能其表达并不完全受巨噬细胞影响,存在其他途径代替调控。6)巨噬细胞、VEGFA、iNOS在着床点的表达高于非着床点,其差异进一步说明巨噬细胞、VEGFA、iNOS不仅与胚胎着床相关,也可能参与了着床点的选择,其具体机制还需要进一步研究。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321

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