去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元活动的调控作用及机制研究

发布时间：2017-11-30 13:00

  本文关键词：去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元活动的调控作用及机制研究

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【摘要】：中枢去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)能系统在多种重要的生理功能中发挥了重要的调节作用。脑干中的蓝斑核(locus coeruleus,LC)是中枢NA的主要来源。尽管NA能神经元的分布主要位于脑干当中,但由这些神经元所发出的纤维广泛投射至包括脊髓在内的整个中枢神经系统。在中枢的不同脑区当中,主要存在三种受体,包括α1、α2以及β受体,介导了NA对不同脑区神经元活动及相关功能的调控。然而,鉴于其受体种类繁多,并且分布模式以及激活后对神经元活动的影响均呈现出多样性,NA参与不同生理功能的细胞分子机制也十分复杂多样,并因此引起了广泛的关注。中枢NA能系统主要通过脑干发出的上行和下行通路,参与中枢不同功能的调节。尽管其上行通路参与认知等脑高级功能的细胞分子层面的机制引起人们广泛的研究兴趣,其下行通路参与不同生理功能的机制近年来也同样受到关注。回顾文献发现,形态学研究表明,下行NA能系统支配了多个与中枢运动控制相关的脑区,并且在脊髓以及内侧脑桥延髓网状结构(medial pontomedullary reticular formation,mPMRF)中存在较高密度的纤维分布。这样的形态学分布特征提示了下行NA能系统在中枢运动功能调节中发挥了重要作用。目前的研究已经揭示了在脊髓运动神经元中,NA主要通过其兴奋性调节作用参与中枢运动功能调节。而mPMRF中存在脊髓投射的网状脊髓神经元,其发出的纤维直接支配脊髓运动神经元,两者作为一个功能性整体在包括躯体姿势控制、节律性运动以及随意运动中的执行中共同发挥了重要作用。然而目前尚不清楚NA是否以及如何调控mPMRF中网状脊髓神经元的活动。脑桥尾侧网状核(caudal pontine reticular nucleus,PnC)是mPMRF的重要组成部分,PnC中的网状脊髓神经元介导了震惊运动(startle)这一姿势调节运动。已有研究表明,在PnC中微量注射NA可以对大鼠震惊反射运动行为的幅度产生显著的调节作用,据此我们推测NA可能通过调控PnC网状脊髓神经元,参与其介导的中枢运动功能调节。回顾文献,目前尚无NA对PnC网状脊髓神经元活动调控机制的报道。因此,本文综合采用形态学、全细胞膜片钳以及神经药理学技术,在细胞水平系统探索了NA对PnC网状脊髓神经元的调控及机制。主要结果如下:1.α1以及α2受体共表达于单个pnc网状脊髓神经元中,其激活共同介导了na对pnc网状脊髓神经元全细胞电流活动的影响。为了明确na作用于pnc网状脊髓神经元的电生理效应,我们将其钳制在-70mv,观察短暂(3min)灌流3μm的na引起的全细胞电流变化。研究结果表明,na(3μm)在一部分pnc网状脊髓神经元中诱发内向电流反应(82/135例,60.7%),而在另一部分pnc神经元中诱发外向电流反应(53/135例,39.3%)。无论是na诱发的内向(p=0.364,n=6)还是外向(p=0.511,n=6)电流反应,均不受ttx(1μm)的影响,提示突触后的na能受体介导了na的效应。结合药理学手段研究后发现,na所诱发的内向电流反应可以被低浓度α1受体阻断剂prazosin(pra,0.01μm)部分阻断(p0.05,n=7),但高浓度的pra(10μm)使na在同一神经元中反转为引起内向外向电流反应。只有同时加入pra(10μm)以及α2受体阻断剂yohimbine(yh,10μm)方可完全阻断na(3μm)对该神经元全细胞电流的影响(p0.01,n=7)。应用同样方法研究后发现,na所诱发的外向电流反应可以被低浓度α2受体阻断剂yh(0.01μm)部分阻断(p0.01,n=6),但高浓度的yh(10μm)使na在同一神经元中反转为引起内向电流反应。只有同时加入pra(10μm)以及yh(10μm)方可完全阻断na(3μm)对该神经元全细胞电流的影响(p0.01,n=6)。上述结果表明,pnc网状脊髓神经元突触后共表达有α1和α2受体,其激活在电压钳钳制于-70mv的pnc网状脊髓神经元中分别介导了内向和外向电流成分,两者经过不同整合后,表现为na在一部分神经元诱发内向电流,而在另一部分诱发外向电流。与此相一致的是,免疫荧光双标结果表明,α1a和α2a受体亚型共表达于pnc中胞体直径大于35μm的网状脊髓神经元中。2.突触后α1和α2受体的激活,分别增加和抑制同一pnc网状脊髓神经元的放电活动。本实验中灌流的acsf中加入了cnqx(10μm)、ap5(20μm)和picrotoxin(100μm),以阻断pnc中的主要兴奋及抑制性突触传递。在此基础上,我们于电流钳模式(i=0)模式,直接记录pnc网站脊髓神经元的放电活动。在该条件下,所有记录的6例神经元均表现出自发放电活动(平均放电频率:4.5±1.5hz;频率变化范围:1.7~11.6hz)。acsf灌流α1受体的激动剂phenylephrine(pe,100μm)显著增加了pnc网状脊髓神经元的放电频率(p0.05;n=6);而在同一个的神经元中,acsf灌流α2受体的激动剂则显著降低了pnc网状脊髓神经元的放电频率(p0.05;n=6)。该结果不仅进一步确认了实验室前期电压钳实验的结果,更进一步揭示了pnc网状脊髓神经元突触后α1以及α2受体的激活可以在神经元活动层次对神经元兴奋性分别起到相反的动态调节作用。3.pnc网状脊髓神经元突触后α1和α2受体激活分别偶联的离子通道机制。在全细胞膜片钳电压钳条件下,应用缓慢的斜坡电压(slowramp)刺激(-125mv~+5mv,dv/dt=+10mv/s),我们可以得到α1以及α2受体激动剂在pnc网状脊髓神经元上所诱导的净电流的电流-电压关系曲线(i-vrelationshipcurve)。(1)突触后α1受体的激活,通过开放下游非选择性阳离子通道调控pnc网状脊髓神经元活动。通过分析发现,应用pe(100μm)激活α1受体所得到的净电流的平衡电位(mean:-29.1±3.0mv;n=15)接近于文献报道的非选择性阳离子通道电导(nonselectivecationicconductance,nscc)的平衡电位。并且在测试电压范围内其i-v曲线均呈现出正向斜率,提示该通道开放介导了α1受体激活对pnc网状脊髓神经元的兴奋性调控效应。进一步应用离子置换实验降低胞外na+浓度(由152.5mm降至70mm)不仅显著降低了α1受体激活后引起的净电流大小(p0.01;152.5mmna+:n=40;70mmna+:n=11),α1受体激活所得到的净电流的平衡电位也符合预期的向更负的方向移动(-42.9±4.2mv;p0.05;152.5mmna+:n=15;70mmna+:n=9)。上述结果表明,α1受体激活后可以激活nscc,调控pnc网状脊髓神经元活动。文献报道nscc主要包含na+以及k+成分,进一步应用翻转电位以及戈德曼-霍奇金-卡茨方程(goldman-hodgkin-katzequation)计算得出在不同胞外na+浓度下的na+/k+通透比例后发现,在两种情况下其比例并无显著差异(p=0.702;n=9)。该结果表明,α1受体激活后可能仅与nscc相偶联。(2)突触后α2受体的激活,通过关闭非选择性阳离子通道和开放k+通道调控pnc网状脊髓神经元活动。激活α2受体所得到的净电流的平衡电位(mean:-23.5±4.3mv;n=10)同样接近于nscc的平衡电位但略高于激活α1受体所得到的净电流的平衡电位(mean:-29.1±3.0mv;n=15)。此外,在其中3列神经元中,除接近于nscc平衡电位的交点外,激活α2受体所得到的净电流同时还存在接近k+平衡电位的交点(mean:-99.3±4.3mv)。该结果提示,与α1受体不同,α2受体下游可能同时偶联了nscc以及k+电导。进一步的离子置换实验表明,胞外na+浓度由152.5mm降至70mm显著减弱了α2受体激活后所引起的净电流幅度(p0.01;152.5mmna+:n=25;70mmna+:n=10)。与此同时,胞外na+浓度由152.5mm将至70mm后,α2受体激活后所引起的净电流在绝大多数测试的神经元(n=6/7)中均呈现出两个平衡电位:-109.9±4.7mv(依然接近于k+平衡电位,并且在低na+条件下出现概率增大)和-28.2±1.0mv(明显高于低na+条件下nscc平衡电位的期待值,该期待值来自低na+条件下α1受体激活后的平衡电位,-42.9±4.2mv)。值得注意的是,在剩下的1个神经元中,α2受体激活后所引起的净电流仅呈现出一个平衡电位,-44.0mv,接近于低na+条件下nscc平衡电位的期待值。该结果表明,α2受体激活偶联了k+通道,并且k+通道的活动可能显著影响在低na+(70mm)条件nscc平衡电位的观测值,并使其向更正的方向移动。的确,在acsf中加入k+通道广谱阻断剂ba2+后,α2受体激活后引起的净电流幅度进一步显著减少(p0.05;70mmna+:n=10;1mmba2+:n=6),并且此时α2受体激活后引起的净电流平衡电位仅存在一个,-44.7±1.3mv(n=6),与上述低na+条件下nscc平衡电位的期待值也不在存在显著差异(p=0.370)。该结果表明,α2受体激活后可以同时偶联k+以及nscc两种电导。并且在阻断钾离子后计算α2受体偶联nscc的na+/k+通透比与α1受体所偶联nscc的na+/k+通透比并不存在显著差异(p=0.671;α1:n=24;α2:n=6),进一步说明两者偶联的为同一类nscc通道。对α2受体激活引起的净电流i-v关系分析发现,其在接近k+平衡电位呈现出正向斜率而在接近nscc附近呈现出负向斜率,说明起激活后可以激活k+电导并关闭nscc。4.α2受体同时还表达于pnc网状脊髓神经元突触前,并介导了na对mepsc的抑制性调控作用。在全细胞膜片钳的基础上进一步应用药理学手段,在pnc网状脊髓神经元上可以分离并记录到微小兴奋性突触后电流(miniatureexcitatorypostsynapticcurrents,mepscs)和微小抑制性突触后电流(miniatureinhibitorypostsynapticcurrents,mipscs)。na既不影响mipscs的频率(p=0.428;n=6),也不影响mipscs的幅度(p=0.508;n=6)。与此不同,na显著抑制了mepscs频率(p0.01;n=7),但并不影响mepscs幅度(p=0.335;n=7)。该结果表明,na通过突触前的机制抑制pnc网状脊髓神经元mepsc。在acsf中灌流α2受体阻断剂后,na对mepscs频率(p=0.145;n=6)及幅度(p=0.994;n=6)均不在产生影响,说明上述效应是由突触前α2受体所介导。与此一致,acsf中灌流α2受体激动剂模拟了na对mepscs频率(p0.05;n=5)的抑制效应,对其幅度(p=0.347;n=5)并无显著影响。该部分结果表明,α2受体同时还表达于pnc网状脊髓神经元突触前,并介导了na对mepsc的抑制性调控作用。5.na对mepsc的抑制效应在功能活动水平,参与了对pnc网状脊髓神经元传入兴奋性信息的抑制性调控作用。在发现α2受体激活后抑制mepsc的基础上,我们进一步想知道其激活对pnc网状脊髓神经元接受的功能性兴奋传入的影响。利用同心圆电极在靠近记录的pnc网状脊髓神经元的位置进行间隔50ms的连续电刺激,我们可以在神经元上记录到近旁刺激所诱发的兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)。ACSF中灌流NA强烈的抑制了eEPSC1的幅度(抑制百分比:47.1±4.9%;n=10)。同时其PPR(EPSC2/EPSC1)显著增加(P0.05;n=10),说明NA可以通过突触前的机制抑制PnC网状脊髓神经元的兴奋性信息传入。在上述神经元上,ACSF灌流α2受体阻断剂,几乎完全阻断了NA对EPSC1的抑制效应(P0.01;n=10),并且NA对PPR也不在产生影响(P=0.572;n=10),说明上述机制由突触前α2受体所介导。进一步我们还发现,NA在1-10μM范围内剂量依赖并稳定的抑制了PnC网状脊髓神经元eEPSC1的幅度,并且伴随的PPR的增加也呈现出剂量依赖趋势。更为重要的是,在所有测试的神经元中,NA对eEPSC的抑制效应与其引起的突触后反应大小无关(r=-0.0219,P=0.621;n=36),从而进一步说明NA上述效应由且仅由突触后α2受体所介导。综上所述,本文研究结果系统阐明了NA对PnC网状脊髓神经元突触后以及突触前的调控效应和机制。该研究结果为NA直接调控中枢运动相关脑区神经元活动,并参与中枢运动功能调节提供了新的神经机制,并为我们下一步的行为学水平研究提供了新的方向。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338

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本文编号：1239365