多亚型流感重组腺病毒疫苗生物反应器制备、纯化及免疫评价

发布时间：2017-12-18 20:24

  本文关键词：多亚型流感重组腺病毒疫苗生物反应器制备、纯化及免疫评价

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【摘要】：流行性感冒是由流感病毒引起的一种严重威胁人类健康的急性呼吸道传染病,在过去的100年里引起了多次流感大流行,导致了严重的公共卫生问题,并造成了巨大的经济损失。疫苗接种是预防流感最有效的方法,但目前应用的疫苗对快速变异的流感病毒缺乏保护,因此研究新型流感疫苗成为当务之急。流感重组腺病毒疫苗是目前的研究热点之一,其稳定性好、表达宿主细胞范围广、能够诱导高水平的外源基因表达。生物反应器微载体培养系统提高了细胞培养的表面积,生长环境单一,培养参数易于监控,成为一种极具吸引力的新型替代技术,用于各种细胞培养工艺放大。大规模生产临床所需的流感重组腺病毒疫苗需要使用安全高效的生产及纯化方法。传统的氯化铯密度梯度离心法适合少量的腺病毒纯化,大规模生产中最有力和万能的方法是色谱柱层析法。阴离子交换层析纯化载量高、成本低廉,分子筛层析纯化条件温和、回收率高,因此腺病毒一般采用这两种层析纯化方式结合的方法进行分离纯化。本实验室前期构建了以季节性流感H3亚型和大流行性流感H1亚型HA(HA1)基因为主,辅助以已经突破种间屏障感染人类的禽流感H5、H7、H9亚型HA抗原Th和B细胞表位盒(EHA)的多表位重组腺病毒疫苗。采用7L生物反应器和Cytodex 1型微载体规模化生产H1、H3等多亚型流感重组腺病毒,发酵产物采用阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化,两步纯化分别选用层析介质Source 30Q和Sepharose 4FF,纯化后的H3亚型流感重组腺病毒鉴定正确后,进行小鼠免疫试验。生物反应器微载体系统培养HEK-293细胞,将2.8×108个细胞(1.6×104cells/mL)接种到生物反应器中,通过多次试验优化培养参数为:温度为37℃,CO2浓度为5%,pH为7.0,溶氧为50%,搅拌速度为30rpm。培养24h后80%以上细胞贴壁,细胞总数开始显著增长,48h-60h增长速率最高,72h后增长速度减慢,细胞数目达到1.4×109个(8×104cells/cm2),增加了5倍。培养96h后细胞细胞数开始下降,逐渐出现细胞坏死和脱落。培养H1、H3等多亚型流感重组腺病毒,以0.5 MOI接种病毒,48h后收取病毒,滴度为1.0×1010TCID50/mL。利用生物反应器制备的重组腺病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,两步纯化后病毒滴度升高至1.1×1010TCID50/mL。经阴离子交换层析纯化回收率为31.5%,分子筛层析纯化回收率为81.4%,两步纯化后回收率为25.6%。对纯化产物进行了PCR和Western blot鉴定证明基因未丢失、蛋白表达正确,通过检测260nm和280nm处吸光度为A260/A280=1.26,初步证明符合纯度要求。将发酵和纯化得到的重组腺病毒进行小鼠免疫实验,对各免疫组进行了体液免疫和细胞免疫水平检测,结果显示在特异性抗原H1,H3刺激下,经过两步纯化的H1、H3等多亚型重组腺病毒IgG表达水平最高。重组腺病毒免疫小鼠后,IL-4和IFN-γ细胞因子水平检测结果表明,两个纯化组表达细胞因子水平相当,显著高于未纯化组。综合分析,经两步纯化的H1、H3等多亚型重组腺病毒具有较强的刺激小鼠产生细胞免疫和体液免疫的能力,经过一步纯化的免疫组水平次之,均高于未纯化组。生物反应器微载体系统制备的H1、H3等多亚型流感重组腺病毒疫苗与种毒刺激小鼠产生的H1、H3亚型特异性体液和细胞免疫反应水平基本相同。以上结果表明:利用生物反应器微载体系统成功制备了H1、H3等多亚型流感重组腺病毒,并通过经过两步法层析纯化进行了分离纯化,为重组腺病毒疫苗的大规模生产奠定了初步的基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
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本文编号：1305506