梅毒螺旋体TpN17重组抗原的表达、纯化及鉴定

发布时间：2017-12-27 14:24

本文关键词：梅毒螺旋体TpN17重组抗原的表达、纯化及鉴定　出处：《昆明理工大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)引起的一种危害性极大的全世界流行的性传播疾病。血清学试验以其快速、简便、经济等优点在临床检测中得到广泛的应用,但是,目前的检测方法依然存在着灵敏性差、假阳性率高、抗原来源相对匮乏等缺点,而采用基因工程抗原代替天然抗原建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)在血清学检测中显示了良好的应用前景。本研究旨在通过基因工程技术制备梅毒螺旋体TpN17重组脂蛋白抗原,为进一步研究开发临床检测效果更好的新型梅毒酶联免疫诊断试剂盒提供实验材料。首先,我们通过PCR的方法从Tp基因组中扩增编码TpN17成熟肽的目的基因片段,经HindⅢ和EcoRI双酶切后,定向克隆至pET-28b(+)中,构建原核表达载体pET-28b(+)/tpn17,转化至E.coli BL21(DE3)中,通过菌体PCR、酶切反应及进一步测序筛选获得了工程菌株BL21/pET-28b(+)/tpn17。工程菌经37℃培养,1.0mmol/L IPTG诱导4h后可获得高表达量的重组蛋白,SDS-PAGE分析显示其分子量约为19kD,与His-TpN17融合蛋白理论分子量值(18.7kD)相符,凝胶扫描分析表明诱导后目的蛋白His-TpN17产量约为菌体蛋白总量的31%。进一步的研究发现,His-TpN17重组蛋白主要以可溶性形式存在于大肠杆菌胞内。纯化过程中我们发现,反复冻融加溶菌酶破碎方法的联合采用以及对破碎后菌体沉淀进行多次洗涤等改进方案可以使目的蛋白更多地释放到可溶性上清粗提液中,经Ni~(2+)螯合层析纯化后,重组蛋白的SDS-PAGE仅在约19kD处显示单一蛋白条带,扫描分析其纯度在95%以上,Western-blot进一步证实该条带确为His-TpN17蛋白纯化后产物,并且该重组抗原与二期梅毒血清发生了很强的免疫反应。
[Abstract]:Syphilis is a worldwide epidemic of sexually transmitted diseases, which are caused by Treponema pallidum (Tp). Serological test for the rapid, simple and economical advantages in clinical detection has been widely used. However, the current detection methods still exist in sensitivity, high false positive rate, the relative lack of source of antigen and other shortcomings, and the use of genetically engineered antigen instead of natural antigen based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in serum detection showed a good application prospect. The aim of this study is to prepare TpN17 recombinant lipoprotein antigen from Treponema pallidum by genetic engineering technology, and provide experimental materials for further research and development of new syphilis ELISA diagnostic kit.
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

【参考文献】